超聲波輔助酶法制備北芪菇抽提物及其抗氧化能力研究

秦 楠,郭麗麗,王小敏,孫 健,李杰玉,張芹仙,李冠文,劉 星

(山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院,山西太原 030619)

北芪菇是一種新型功能食用菌,產(chǎn)自山西省渾源縣,結(jié)合其74 km2富硒地區(qū)的地理資源優(yōu)勢(shì),在平菇中添加黃芪(亦稱(chēng)“北芪”)培育而成。除具有平菇普通營(yíng)養(yǎng)、功能成分以外,氨基酸、多糖、總黃酮含量顯著高于平菇,尤其硒含量較普通平菇提高15%[1]。在抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、抗氧化、改善心腦血管疾病、調(diào)節(jié)免疫,促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)、助消化等方面表現(xiàn)出良好的藥理作用[2-3]。其中,多糖、黃酮類(lèi)物質(zhì)具有優(yōu)良的抗氧化活性,能夠有效緩解氧化壓力,對(duì)疾病預(yù)防和治療有一定的意義[4-5]。

目前,關(guān)于北芪菇抽提物及其黃酮類(lèi)物質(zhì)的研究還未見(jiàn)報(bào)道,其中粗多糖研究報(bào)道亦相對(duì)較少。邵偉等[6]利用雙孢菇菇柄和殘次菇為原料,在40 ℃、pH7.0和1.0% NaCl的條件下經(jīng)菇體自溶,獲得雙孢蘑菇抽提物,總氮含量達(dá)到6.4 g/100 g，氨基酸態(tài)氮可達(dá)3.1 g/100 g。曹春蕾等[7]對(duì)3種木層孔菌的不同溶劑提取物進(jìn)行了體外抗氧化活性研究,結(jié)果表明不同溶劑提取物都具有清除DPPH自由基、羥自由基的能力。繆成貴等[8]對(duì)雙孢蘑菇總黃酮抗油脂氧化研究發(fā)現(xiàn),抗氧化性隨總黃酮含量增加而提高。

本實(shí)驗(yàn)探討了以纖維素酶酶解北芪菇制備抽提物的工藝條件,并對(duì)該抽提物進(jìn)行了體外抗氧化試驗(yàn)，旨在開(kāi)發(fā)一種集營(yíng)養(yǎng)、調(diào)味及保健于一體的天然物質(zhì),可用于復(fù)合調(diào)味品調(diào)配、高品質(zhì)醬油生產(chǎn)等,作為一種理想的食品添加劑在食品中廣泛應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

北芪菇 山西大同渾源縣;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS) 美國(guó)Sigma公司;硫酸亞鐵、水楊酸、H2O2、稀鹽酸、甲醛、乙醇、氫氧化鈉、纖維素酶(均為分析純) 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；試驗(yàn)用水 蒸餾水。

SB-5200DT超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技有限公;DS-1高速組織搗碎機(jī) 江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所;TGL-20B離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;TP310酸度計(jì) 北京時(shí)代新維測(cè)控設(shè)備有限公司;0-32手持型折光儀 上海勃基儀器儀表有限公司:HH-1恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司;HS-12磁力攪拌器 北京金紫光儀器儀表公司;AR323CN電子天平 奧豪斯儀器(常州)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 北芪菇抽提物制備工藝 將新鮮北芪菇切碎成丁,經(jīng)過(guò)高速組織搗碎機(jī)組織勻漿,按一定的水料比混勻,加入一定量纖維素酶,調(diào)整pH后放入超聲波提取器中提取50 min。95 ℃水浴保溫10 min方式滅酶,在4 ℃下5000 r/min離心15 min,取上清液,冷凍干燥,即得北芪菇抽提物。

1.2.2 北芪菇抽提物制備單因素實(shí)驗(yàn) 本試驗(yàn)選擇水料比、超聲時(shí)間、超聲溫度、酶用量、pH進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),以氨基態(tài)氮含量和可溶性固形物含量為指標(biāo),不同因子梯度條件見(jiàn)表1。

表1 單因素水平設(shè)計(jì)表Table 1 Horizontal design of single factor

1.2.3 響應(yīng)曲面法試驗(yàn)設(shè)計(jì) 基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選用中心組合試驗(yàn)Box-Behnken設(shè)計(jì)方案,選取酶用量、超聲時(shí)間和水料比三個(gè)變量,以A、B、C來(lái)表示,并以1、0、-1分別代表其變量的水平,按方程x=(X-X0)/ΔX對(duì)自變量進(jìn)行編碼,其中,x 表示變量的編碼值,X表示變量的真實(shí)值,X0表示試驗(yàn)中心點(diǎn)變量的真實(shí)值,ΔX表示變量的步長(zhǎng)變化,氨基態(tài)氮含量Y表示響應(yīng)值,見(jiàn)表2。

表2 中心組合試驗(yàn)Box-Behnken設(shè)計(jì)因素和水平編碼值Table 2 Independent variables and levels in Box-Behnken

1.2.4 氨基態(tài)氮含量和可溶性固形物含量的測(cè)定 氨基態(tài)氮測(cè)定:甲醛滴定法[9];可溶性固形物含量測(cè)定:手持式折光儀[10]。

1.2.5 黃酮含量的測(cè)定 精密稱(chēng)量10 mg蘆丁于50 mL容量瓶中,用60%的乙醇溶解至刻度,得到濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別量取1、2、3、4、5 mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL的容量瓶中,加入60%乙醇5 mL,精密加5%亞硝酸鈉溶液5 mL,放置6 min,加入10%的硝酸鋁0.5 mL,放置6 min,加入4%的氫氧化鈉5 mL,用60%的乙醇定容,室溫放置6 min,于510 nm處測(cè)定吸光度。

以濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo),吸光度A為縱坐標(biāo)繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密稱(chēng)取北芪菇酶法抽提物1.0 g稀釋102倍,準(zhǔn)確吸取稀釋后樣品溶液5 mL置于25 mL的容量瓶中,按照上述方法測(cè)定吸光度,重復(fù)三次,計(jì)算北芪菇酶法抽提物中黃酮的含量[11-12]。Y=0.043x+0.0554，R2=0.9993。

1.2.6 抗氧化活性的測(cè)定

1.2.6.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定 分別吸取2 mL 2×10-4mol/L的DPPH溶液和1 mL質(zhì)量濃度分別為200、300、400、500、600 mg/mL北芪菇抽提物液于比色管中,混勻,避光靜置30 min,于517 nm處測(cè)定吸光度A樣,用1 mL蒸餾水代替樣液測(cè)定其吸光度值A(chǔ)空白,以VC作為陽(yáng)性對(duì)照[13]。樣品對(duì)DPPH的清除率為:DPPH清除率(%)=(A空白-A樣)/A空白×100。

1.2.6.2 ABTS+自由基清除率的測(cè)定 ABTS自由基的制備:將7 mmol/L的ABTS溶液與2.45 mmol/L的過(guò)硫酸鉀溶液混合(1∶0.5,V/V),置室溫黑暗條件下放置12～16 h后備用,使用前用無(wú)水乙醇稀釋至吸光度在734 nm處為0.7±0.02[14]。在同一具塞試管中加入3 mL的ABTS自由基溶液和150 μL北芪菇抽提物,避光反應(yīng)6 min后于734 nm處測(cè)定其吸光度值A(chǔ)樣,用無(wú)水乙醇代替樣品測(cè)定A空白。以VC作為陽(yáng)性對(duì)照。

ABTS+·的清除率(%)=(A空-A樣)/A空白×100

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用GraphPad Prism 5和Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,運(yùn)用最小差異顯著法(LSD)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抽提物工藝單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 水料比對(duì)制取北芪菇抽提物的影響 由圖1可知,隨著水料比增大,氨基態(tài)氮與固形物含量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì),當(dāng)水料比為10∶1 mL/g時(shí),氨基態(tài)氮與固形物含量均達(dá)到最大值,水料比對(duì)其影響極顯著(P<0.01)。當(dāng)水料比大于10∶1,兩者含量明顯降低,可能是由于水量增大致使菇水混合液變稀,溶出物減少,進(jìn)而使氨基態(tài)氮收率降低,且固形物含量減少[17]。故選取水料比10∶1 mL/g為宜。

圖1 水料比對(duì)北芪菇抽提物的影響Fig.1 Effect of ratio of water to material on Astragali mushroom extracts

2.1.2 酶用量對(duì)北芪菇抽提物的影響 由圖2可知,隨酶用量增大,北芪菇抽提物氨基態(tài)氮與固形物含量均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。酶用量為0.5%時(shí)氨基態(tài)氮含量達(dá)到最高值,然后含量降低;可溶性固形物含量在酶用量為0.3%時(shí)達(dá)到最高值,然后緩慢減少,酶用量對(duì)其影響極顯著(P<0.01)。這是由于隨著酶用量的增加,酶與底物接觸機(jī)會(huì)增大,導(dǎo)致內(nèi)容物從細(xì)胞中分離出來(lái)使氨基態(tài)氮收率與固形物含量上升。而當(dāng)酶量添加到一定程度時(shí)內(nèi)容物已完全溶出,過(guò)量的酶無(wú)貢獻(xiàn)反而會(huì)導(dǎo)致內(nèi)容物降解致使收率減少,固形物含量下降[18-19]。綜合考慮,故選取酶用量0.5%為宜。

圖2 酶用量對(duì)北芪菇抽提物的影響Fig.2 Effect of enzyme dosage on Astragali mushroom extracts

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)北芪菇抽提物的影響 由圖3可知,隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng),北芪菇抽提物氨基態(tài)氮與固形物含量呈先升高后降低趨勢(shì)。40 min時(shí)氨基態(tài)氮與固形物含量均達(dá)到了最大值,當(dāng)大于40 min后含量都逐漸降低,酶用量對(duì)其影響極顯著(P<0.01)。由于超聲時(shí)間越長(zhǎng)空化效應(yīng)越強(qiáng),氨基態(tài)氮損失較大導(dǎo)致收率降低,固形物含量減少[20]。故選取超聲時(shí)間40 min為宜。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)制取北芪菇抽提物的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on Astragali mushroom extract

2.1.4 超聲溫度對(duì)北芪菇抽提物的影響 由圖4可知,隨著超聲溫度的提高,北芪菇抽提物氨基態(tài)氮與固形物含量呈均現(xiàn)出先增大后降低的趨勢(shì),40 ℃時(shí)氨基態(tài)氮與固形物含量都達(dá)到最高值。這是由于溫度對(duì)纖維素酶與內(nèi)源酶系有較大影響,溫度過(guò)高會(huì)破壞酶活性,導(dǎo)致蛋白質(zhì)等物質(zhì)分解不徹底,內(nèi)容物析出減少,因此造成氨基態(tài)氮收率與固形物含量下降[21]。故選取超聲溫度40 ℃。

圖4 超聲溫度對(duì)芪菇抽提物的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on Astragali mushroom extracts

2.1.5 pH對(duì)制取北芪菇抽提物的影響 由圖5可知,隨著pH提高,北芪菇抽提物氨基態(tài)氮與固形物含量呈均現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)。pH4時(shí)氨基態(tài)氮與固形物含量都達(dá)到最大值。由于pH影響外源酶與內(nèi)源酶系的活力,pH過(guò)高使酶活受限,導(dǎo)致北芪菇子實(shí)體分解不徹底,且內(nèi)容物析出量降低,因此氨基態(tài)氮收率與固形物含量呈下降趨勢(shì)[22]。故選取pH為4為宜。

圖5 pH對(duì)制取北芪菇抽提物的影響Fig.5 Effect of pH value on Astragali mushroom extract

2.2 響應(yīng)面法分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析 利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表5的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)多元回歸擬合,獲得氨基態(tài)氮含量(Y),酶用量(A)、超聲時(shí)間(B)和水料比(C)的二次多項(xiàng)回歸模型為:

Y=0.72+0.036A+0.0058B-0.05C+0.0002AB-0.99AC-0.013BC-0.14A2-0.18B2-0.23C2

從方差分析表4中可知,模型F值為47.60,P值為P<0.0001,達(dá)到極顯著水平,失擬項(xiàng)P=0.0629>0.05不顯著,表明該模型與試驗(yàn)擬合程度高,模型精度高,試驗(yàn)誤差小,能夠用此回歸方程推測(cè)抽提物工藝條件對(duì)氨基態(tài)氮含量的影響。回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果:水料比(C)的一次項(xiàng)及二次項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值的影響極顯著(P<0.01),超聲時(shí)間(B)的二次項(xiàng)極顯著(P<0.01),酶用量(A)的一次項(xiàng)顯著(P<0.05),二次項(xiàng)極顯著(P<0.01),超聲時(shí)間(B)一次項(xiàng)及交互項(xiàng)均不顯著。由F值得出試驗(yàn)各因素影響抽提物中氨基態(tài)氮含量的主次順序?yàn)樗媳?C)>酶用量(A)>超聲時(shí)間(B)。

表3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Design and test results of response surface

表4 二次回歸模型的方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance for each item of developed quadratic regression model

根據(jù)模型方程繪制響應(yīng)面圖,分別見(jiàn)圖6。其中每個(gè)響應(yīng)面分別代表兩個(gè)變量在恒定值(取零水平值)下,另外兩個(gè)獨(dú)立變量之間的相互作用。

圖6 兩因素交互作用對(duì)氨基態(tài)氮含量的影響Fig.6 Interactive effects of extraction parameters on the amino nitrogen content

由圖6a所示,當(dāng)水料比處在中心點(diǎn)時(shí),酶用量在0.3%～0.7%范圍內(nèi),隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng),氨基態(tài)氮含量先升高,當(dāng)用量達(dá)到0.5%后,氨基態(tài)氮含量緩慢下降。同樣當(dāng)超聲時(shí)間在30～50 min范圍內(nèi),氨基態(tài)氮含量先升高,達(dá)到最大值后再緩慢下降。由圖6b所示,當(dāng)超聲時(shí)間處在中心點(diǎn)時(shí),酶用量在0.3%～0.7%范圍內(nèi),隨著水料比的增大,氨基態(tài)氮含量先顯著升高,達(dá)到最大值后再逐漸下降。同樣當(dāng)水料比在5∶1～15∶1 mL/g范圍內(nèi),隨著酶用量增加,氨基態(tài)氮含量先急劇增大,達(dá)到最大值后陡然下降。由圖6c所示,當(dāng)酶用量處在中心點(diǎn)時(shí),超聲時(shí)間在30～50 min范圍內(nèi),隨著水料比的增大,氨基態(tài)氮含量先緩慢升高,達(dá)到最大值后再逐漸下降。同樣當(dāng)水料比在5∶1～15∶1 mL/g范圍內(nèi),隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng),氨基態(tài)氮含量陡然升高,達(dá)到最大值后再急劇下降。

2.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 由Design-Expert軟件分析得出北芪菇抽提物制取的最佳條件是:酶用量0.52%、超聲時(shí)間40 min、水料比12.37∶1 mL/g,理論最佳氨基態(tài)氮含量為0.760 mg/mL,黃酮含量6.5%±0.25%。考慮到實(shí)際操作的方便性,將北芪菇抽提物的制取條件修正為酶用量0.5%、水料比12∶1 mL/g、超聲時(shí)間40 min、超聲溫度40 ℃、pH4。在上述條件下設(shè)置三個(gè)重復(fù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),平均值為(0.765±0.12) mg/mL,與預(yù)測(cè)值擬合度良好,無(wú)顯著性差異(P>0.05),表明試驗(yàn)確定的模型條件可以用于預(yù)測(cè)實(shí)際值,此方程有效可靠。

2.3 抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除率 如圖7所示,隨著抽提物質(zhì)量濃度的增大,清除DPPH自由基的能力呈現(xiàn)正相關(guān)。當(dāng)質(zhì)量濃度為200～400 μg/mL范圍內(nèi),對(duì)DPPH自由基的清除率緩慢增大。當(dāng)質(zhì)量濃度大于400 μg/mL時(shí),清除率顯著增高,當(dāng)達(dá)到600 μg/mL時(shí),與同質(zhì)量濃度的VC標(biāo)準(zhǔn)品相比,清除DPPH自由基的能力高于對(duì)照。通過(guò)方差分析表明,各質(zhì)量濃度間對(duì)DPPH自由基的清除能力的差異顯著,在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)抽提物與清除能力表現(xiàn)出劑量(質(zhì)量濃度)-效應(yīng)關(guān)系。

圖7 不同濃度抽提物對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effect of extracts with different concentrations on DPPH free radical

2.3.2 ABTS+自由基清除率 如圖8所示,抽提物對(duì)ABTS+自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度的增大呈現(xiàn)增大趨勢(shì)。當(dāng)質(zhì)量濃度為200～300 μg/mL時(shí),清除率增幅顯著(P<0.05),在300～600 μg/mL時(shí),清除率依然增大,但趨勢(shì)較平穩(wěn),與同質(zhì)量濃度的VC標(biāo)準(zhǔn)品相比,清除ABTS+自由基的能力低于對(duì)照。

圖8 不同濃度抽提物對(duì)ABTS+自由基的清除作用Fig.8 Scavenging effect of extracts with different concentrations on ABTS+ free radical

2.3.3 ·OH清除率 如圖9所示,在抽提物質(zhì)量濃度200～600 mg/mL范圍內(nèi)服從線性分布,抽提物對(duì)羥自由基清除率隨著其質(zhì)量濃度的增加而增大,說(shuō)明抽提物對(duì)羥自由基清除力的大小與其質(zhì)量濃度呈現(xiàn)正相關(guān)。與同質(zhì)量濃度的VC標(biāo)準(zhǔn)品相比,抽提物清除羥自由基能力相對(duì)較弱。

圖9 不同濃度抽提物對(duì)羥自由基的清除作用Fig.9 Scavenging effect of extracts with different concentrations on ·OH

3 結(jié)論與討論

北芪菇抽提物富含多種營(yíng)養(yǎng)與功能成分,結(jié)合前期抽提物功能成分測(cè)定的結(jié)果,對(duì)于調(diào)節(jié)免疫、降血糖或降血脂等其他保健功效有待于進(jìn)一步研究。