大豆多肽-鋅螯合物的制備工藝優化及其結構表征

鄭英敏,袁 楊,蘇東曉,何 山,許慶陵,曾慶祝

(廣州大學化學化工學院,廣東廣州 510006)

大豆分離蛋白是從大豆油脂工業副產物——豆粕中提取出的一種蛋白質[1]。作為富含人體所需的8種必需氨基酸,其含量滿足人體需求的植物蛋白[2],大豆分離蛋白因其高營養價值、出色的加工性能和低成本而廣泛應用于食品行業中[3]。據報道,通過Alcalase酶酶解得到的大豆多肽已被證實具有抗氧化性和ACE抑制活性[4-5],而通過Flavourzyme酶酶解的大豆蛋白水解物則具有促進脂肪代謝的生理功能[6]。

鋅是人體中僅次于鐵的第二大過渡金屬元素,以二價陽離子形式存在,并在細胞代謝和凋亡過程包括中起著關鍵作用。鋅是銅鋅超氧化物歧化酶、碳酸酐酶、抗氧化酶和其他基質金屬蛋白酶的酶促輔因子,參與碳水化合物、脂肪和蛋白質的代謝調節[7]。據報道,缺乏鋅會導致多種疾病,包括生長受損、免疫系統缺陷、皮炎、腹瀉、性和骨骼成熟延遲,味覺受損,妊娠結局不良以及神經行為改變等[8]。

從飲食中補充的鋅元素容易與植酸形成不溶性絡合物從而降低鋅的生物利用度[9]。多肽在一定配比、溫度、pH等條件下與微量金屬離子通過螯合反應制得多肽金屬離子螯合物[10]。大量研究表明,金屬離子氨基酸螯合物比無機鹽具有更好的穩定性,更強的抗干擾性和更高的生物利用度。乳清多肽-亞鐵螯合物[11]和牡蠣-鋅螯合物[12]在模擬胃腸液消化實驗中比相應的無機鹽顯示更好的離子溶解度。在Caco-2細胞的實驗中,乳清多肽的鋅及鈣螯合物的離子吸收明顯高于無機鹽[13-14]。膠原蛋白肽的鈣螯合物能顯著增加大鼠股骨礦物質密度和股骨鈣含量[15]。Chaud等[16]通過動物實驗證明,酪蛋白肽-亞鐵螯合螯合物在大鼠血紅蛋白轉化率上與硫酸亞鐵效果一致。因此,蛋白肽的金屬離子螯合物形式被認為是新的營養補充劑。除此之外,多肽金屬離子螯合物還顯出抑菌性[17]、抗疲勞功能[18]和抗氧化性[19-20]。

已有作者如馬利華[21]和趙薇等[22]研究過豆粕多肽鋅螯合物的體外抗氧化性能和制備方法,但缺少對其結構的研究,因此本文通過酶解大豆分離蛋白制備大豆多肽,進而制取多肽-鋅螯合物,并采用紫外光譜、傅立葉紅外光譜、熒光光譜、電子掃描顯微鏡和Zeta電位等手段方法對大豆多肽-鋅螯合物的初級結構進行表征,以期為多肽-鋅螯合物的進一步深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆分離蛋白、氯化鋅(分析純)、溴化鉀(光譜純) 上海麥克林生化科技有限公司;Alcalase酶 2.4 L FG,諾維信生物技術有限公司;其余試劑 均為國產分析純。

PHS-3C酸度計 上海精密科學儀器有限公司;PL403電子分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;HH4C水浴振蕩器 金壇市鴻科儀器廠;GL-2050MS冷凍離心機 盧湘儀儀器有限公司;SCIENTZ-18N真空冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司;Vivaflow200超濾膜 德國賽多利斯;NexION電感耦合等離子體質譜儀 美國PerkinElmer公司;300UV-2600紫外-可見光分光光度計 日本島津儀器有限公司;TENSOR II+Hyperion2000傅立葉變換紅外光譜儀 布魯克公司;F-4500熒光分光光度計 日本日立公司;JSM-7001F掃描電子顯微鏡 日本JEOL公司;Nano-2s ZEN3600納米粒度電位儀 英國馬爾文儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆多肽制備 將大豆分離蛋白溶解在蒸餾水中,濃度為10%。用1 mol/L NaOH將大豆分離蛋白懸液的pH調節至8.0,并在55 ℃水浴中加熱10 min,然后加入Alcalase酶,酶與底物比例為1∶50 (W/W)。然后在55 ℃和pH8.0的條件下酶解3 h。酶解結束后,將酶解液置于沸水浴中加熱5 min滅酶。冷卻至室溫,調節pH至7.0隨后8000 r/min離心15 min。取上清液經截留分子量5 kDa超濾膜分離,經冷凍干燥后即為大豆多肽[23]。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 ZnCl2濃度對大豆多肽鋅螯合能力的影響 稱取一定質量的大豆多肽分別溶解于125、250、375、500和625 μmol/L的ZnCl2溶液中,使大豆多肽濃度為1 mg/mL,將混合液pH調節至4.0。將混合液置于60 ℃水浴中反應3 h。得到大豆多肽-鋅螯合物溶液,經無水乙醇沉淀、冷凍干燥制得多肽-鋅螯合物固體備用,并測定其鋅螯合能力。

1.2.2.2 螯合溫度對大豆多肽鋅螯合能力的影響 稱取一定質量的大豆多肽溶解于375 μmol/L的ZnCl2溶液中,使大豆多肽濃度為1 mg/mL,調節pH至4.0。將混合液置于不同溫度(40、50、60、70、和80 ℃)中水浴反應3 h。得到大豆多肽-鋅螯合物溶液,經無水乙醇沉淀、冷凍干燥制得多肽-鋅螯合物固體備用,并測定其鋅螯合能力。

1.2.2.3 pH對大豆多肽鋅螯合能力的影響 稱取一定質量的大豆多肽溶解于375 μmol/L的ZnCl2溶液中,使大豆多肽濃度為1 mg/mL,用1 mol/L HCl和NaOH溶液調節混合液pH(2.0、3.0、4.0、5.0和6.0)。將混合液置于60 ℃水浴中反應3 h。得到大豆多肽-鋅螯合物溶液,經無水乙醇沉淀、冷凍干燥制得多肽-鋅螯合物固體備用,并測定其鋅螯合能力。

1.2.2.4 螯合時間對大豆多肽鋅螯合能力的影響 稱取一定質量的大豆多肽溶解于375 μmol/L的ZnCl2溶液中,使大豆多肽濃度為1 mg/mL,調節pH至4.0。將混合液置于60 ℃水浴中分別反應1、2、3、4和5 h。得到大豆多肽-鋅螯合物溶液,經無水乙醇沉淀、冷凍干燥制得多肽-鋅螯合物固體備用,并測定其鋅螯合能力。

1.2.3 正交試驗 以鋅螯合能力為評價指標,在單因素試驗基礎上選取ZnCl2濃度、溫度、pH、時間為試驗因素,選用L9(34)正交表進行3因素3水平正交實驗優化(表1),確定大豆多肽螯合鋅的最佳條件。

表1 正交試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.4 鋅螯合能力的測定 根據GB 5009.14-2017食品中鋅的測定中的電感耦合等離子體質譜法法,測定單因素實驗及正交試驗中大豆多肽-鋅螯合物固體的鋅含量,結果用每克多肽上螯合的鋅質量表示,即mg/g多肽。

1.2.5 大豆多肽-鋅螯合物結構表征

1.2.5.1 紫外吸收光譜 取一定質量的大豆多肽及大豆多肽-鋅螯合物固體溶解于去離子水中,使其濃度為1 mg/mL。在測量之前,用去離子水對紫外可見分光光度計進行基線調零,測定樣品溶液190～600 nm的吸光值。

1.2.5.2 紅外光譜 分別取2 mg的大豆多肽及大豆多肽-鋅螯合物與200 mg光譜純KBr于瑪瑙研缽中研磨均勻。制成薄片后測定紅外吸收光譜。以4 cm-1的分辨率記錄樣品在4000～400 cm-1的光譜,平均掃描16次。

1.2.5.3 熒光光譜 取一定質量的大豆多肽分別溶解于0、2、4、6、8和10 μmol/L ZnCl2溶液中,使其濃度為100 μg/mL,調節溶液pH至5.5,于75 ℃恒溫水浴中反應1 h。樣品在激發波長280 nm下測定熒光光譜[24]。

1.2.5.4 掃描電子顯微鏡 取一定量大豆多肽、大豆多肽-鋅螯合物粉末于導電膠上,經噴金鍍膜處理后放入掃描電鏡抽真空,觀察樣品形貌。

1.2.5.5 Zeta電位 分別稱取一定質量的大豆多肽和大豆多肽-鋅螯合物溶解于去離子水中,使其濃度為1 mg/mL,用HCl或NaOH將溶液pH調節至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0,測定其Zeta電位。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 ZnCl2濃度對大豆多肽鋅螯合能力的影響 由圖1可知,ZnCl2濃度在125～375 μmol/L范圍,大豆多肽鋅螯合能力隨ZnCl2濃度的上升而增大。當ZnCl2濃度為375 μmol/L時,大豆多肽螯合能力為(16.76±0.35) mg/g。由此可知,當ZnCl2濃度為375 μmol/L時,大豆多肽中的鋅螯合位點已達到飽和狀態。所以在后續的正交實驗中,選擇ZnCl2濃度為375 μmol/L。

圖1 ZnCl2濃度對大豆多肽鋅螯合能力的影響Fig.1 Effect of ZnCl2 concentration on zinc-chelating capacity of soy peptides 注:不同小寫字母表示顯著性差異(P<0.05)；圖2～圖4同。

2.1.2 螯合溫度對大豆多肽鋅螯合能力的影響 由圖2可知,溫度對大豆多肽鋅螯合能力的影響較大。隨著溫度的增加,大豆多肽的鋅螯合能力也隨之增加,在70 ℃時達到最大(24.65±0.48 mg/g),隨后下降。在40～70 ℃內,反應溫度越高,螯合反應的反應速率和平衡系數越大,然而,過高溫度會導致多肽變性,從而導致大豆多肽鋅螯合能力下降[25]。因此,選擇70 ℃進行后續實驗。

圖2 溫度對大豆多肽鋅螯合能力的影響Fig.2 Effect of temperature on zinc-chelating capacity of soy peptides

2.1.3 pH對大豆多肽鋅螯合能力的影響 圖3展現了不同pH下的多肽鋅螯合能力。在pH5.0時多肽的鋅螯合能力達到最大,為(18.05±0.59 mg/g)。當pH小于5.0時,多肽的鋅螯合能力隨著pH的減小而下降,這是因為H+會與金屬離子競爭給電子基團,使多肽的鋅螯合能力降低[26]。當pH大于5.0時,多肽的鋅螯合能力也減小,因為反應體系中的Zn2+與OH-生成不溶性Zn(OH)2沉淀,使得體系中的Zn2+不能充分與大豆多肽進行螯合反應[12]。因此選擇pH5.0進行后續實驗。

圖3 pH對大豆多肽鋅螯合能力的影響Fig.3 Effect of pH on zinc-chelating capacity of soy peptides

2.1.4 螯合時間對大豆多肽鋅螯合能力的影響 從圖4得知,大豆多肽與鋅的螯合能力隨著螯合時間的上升而上升,在反應為3 h時達到最大值(16.04±0.63 mg/g),隨后下降。然而反應時間的改變對大豆多肽的鋅螯合能力影響并不顯著。因此在后續的正交實驗中將選擇1 h作為螯合時間,并不再作為后續正交實驗的實驗因素。

圖4 時間對大豆多肽鋅螯合能力的影響Fig.4 Effect of time on zinc-chelating capacity of soy peptides

2.2 正交實驗結果

由表2中R值可知,試驗中溫度對大豆多肽鋅螯合能力影響最大,其次為pH,最后是ZnCl2濃度。由正交實驗結果可知,最佳的反應條件為第7組A3B1C3,即ZnCl2濃度450 μmol/L,溫度65 ℃,pH5.5。但通過極差分析得到的優方案為A3B3C3,即ZnCl2濃度450 μmol/L,溫度75 ℃,pH5.5。再就這兩組方案進行對比實驗,最終確定出最優反應條件為A3B3C3,在此條件下大豆多肽螯合能力為(26.96±1.22) mg/g。

表2 大豆多肽鋅螯合能力正交優化試驗結果Table 2 Results of zinc-chelating capacity of soy peptides by orthogonal optimization test

2.3 大豆多肽-鋅螯合物結構表征

2.3.1 紫外吸收光譜 圖5為大豆多肽和大豆多肽-鋅螯合物的紫外吸收光譜。大豆多肽在205 nm處出現強的吸收峰,在273 nm處出現一個弱吸收峰。這兩個吸收峰分別是由肽鍵的發色基團(C=O)發生π→π*躍遷和酪氨酸中的苯環引起的[27-28]。而大豆多肽-鋅螯合物的紫外吸收峰發生明顯的移動和強度變化。大豆多肽-鋅螯合的最大吸收峰移動至224 nm,吸收強度降低,而較弱的吸收峰發生藍移且吸收強度增大。結果表明,當大豆多肽-鋅螯合物生成,發色基團(-C=O,-COOH)和助色基團(-OH,-NH2)發生偏振變化[29]。黃瓜種子肽-鈣螯合物[28]和豬骨膠原肽-鈣螯合物[30]也呈現出相似的紫外光譜。紫外光譜的變化證明大豆多肽和鋅離子之間發生了螯合反應。

圖5 大豆多肽-鋅螯合物及大豆多肽紫外吸收光譜Fig.5 UV spectra of soy peptides-Zn chelate and soy peptides

2.3.2 傅立葉紅外光譜 圖6為大豆多肽及大豆多肽-鋅螯合物的紅外光譜。在大豆多肽的紅外光譜中,出現了由N-H鍵的拉伸振動引起的吸收峰[12,31](3471.62 cm-1),而在大豆多肽-鋅螯合物中該吸收峰移動至3417.27 cm-1。這表明感應效應或偶極場效應改變了-NH2的電子云密度[27],說明-NH參與了多肽與鋅離子的螯合反應。在大豆多肽的紅外光譜中,波長為1657.81 cm-1的吸收峰對應-C=O[27,32]。在大豆多肽-鋅螯合物中,該吸收峰移動至1650.65 cm-1;出現了一個由-COO-Zn引起的新吸收峰[33](1242.64 cm-1),以上表明多肽中的羧基為螯合位點之一。與鋅離子螯合后,大豆多肽中的吸收峰(864.70和529.70 cm-1)分別移動至857.54和536.86 cm-1,這說明多肽與鋅離子的螯合反應使-N-H電子云密度降低[29]而-O=C-NH2電子云密度增加[33]?？偨Y紅外光譜結果,可以推斷出大豆多肽與鋅離子的螯合位點為羧基、氨基以及肽鍵[14,34]。

圖6 大豆多肽-鋅螯合物及大豆多肽紅外光譜Fig.6 FTIR spectra of soy peptides-Zn chelate and soy peptides

2.3.3 熒光光譜 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸可以產生內源性熒光,因此可以用熒光光譜來探究蛋白質或多肽和其他物質間的相互作用[14]。在280 nm激發波長下,發射峰305和348 nm分別對應酪氨酸和色氨酸[29]。從圖7中可得知,隨著Zn2+濃度的增加,大豆多肽-鋅螯合物在305和348 nm出的熒光強度逐漸下降,這是由鋅離子導致多肽的折疊造成的[24]。根據Beyer等[35]的報道,金屬離子能促進多肽的折疊。因此多肽和鋅離子的螯合反應使多肽發生折疊,從而使熒光強度略微下降。

圖7 大豆多肽-鋅螯合物及大豆多肽紅外熒光光譜Fig.7 Fluorescence spectra of soy peptides-Zn chelate and soy peptides

2.3.4 掃描電子顯微鏡 圖8分別為大豆多肽粉末及大豆多肽-鋅螯合物粉末的形態圖?？梢钥闯?二者均為不規則的顆粒體,大豆多肽粉末為比較平滑的塊狀外觀,而大豆多肽-鋅螯合物粉末則呈現出顆粒凹凸狀態。有文獻報道,金屬離子能使Aβ肽迅速聚集,形成寡聚物[36]。Dionisio等[37]指出鋅離子可能在兩個多肽的結合位點上充當橋接配體。因此,可以推測,大豆多肽粉末和大豆多肽-鋅螯合物粉末的形貌區別可能是由于多肽與鋅離子發生了螯合反應,形成了多肽-鋅螯合物微顆粒。

圖8 大豆多肽及大豆多肽-鋅螯合物掃描電子顯微鏡圖譜Fig.8 SEM of soy peptides and soy peptides-Zn chelate

2.3.5 Zeta電位 圖9為大豆多肽和大豆多肽-鋅螯合物在不同pH下的Zeta電位?？梢钥闯?大豆多肽和大豆多肽-鋅螯合物的Zeta電位變化程度不同,當pH超過2.7,大豆多肽-鋅螯合物的Zeta電位開始低于大豆多肽的Zeta電位。在本實驗的pH范圍內,隨著pH的增加,多肽-鋅螯合物的穩定性比大豆多肽差,說明鋅離子和多肽的部分基團結合形成螯合物以后促進了聚集作用的發生,更加有利于形成微顆粒[38]。

圖9 大豆多肽及大豆多肽-鋅螯合物在不同pH下的Zeta電位曲線Fig.9 Zeta potential curve of soy peptides and soy peptides-Zn complex at different pH values

3 結論

本研究通過單因素及正交試驗確定大豆多肽-鋅螯合物的制備條件為:多肽與鋅的反應溫度75 ℃,溶液pH5.5以及氯化鋅濃度為450 μmol/L。在此條件下的鋅螯合能力為(26.96±1.22) mg/g。通過紫外吸收光譜和紅外光譜確定生成了大豆多肽-鋅螯合物,其螯合位點為多肽的羧基、氨基和肽鍵。熒光光譜、電子掃描顯微鏡和Zeta電位的結果表明,在Zn2+與大豆多肽的螯合過程中,受到Zn2+的影響,加強了多肽分子內和分子間的相互作用,從而促進折疊和聚集形成多肽-鋅螯合物的微顆粒?；诖蠖苟嚯牡匿\螯合物為開發新的鋅補充劑提供了研究思路和理論基礎。