超高效液相色譜-串聯質譜結合譜庫檢索快速測定雞蛋中氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素殘留

(寧波市食品檢驗檢測研究院,浙江寧波 315048)

氯霉素(chloramphenicol,CAP)、氟苯尼考(florfenicol,FF)和甲砜霉素(thiamphenicol,TAP)同屬酰胺醇類抗生素(圖1),具有廣譜抗菌性。但氯霉素因其苯環上的硝基基團,對人、畜禽有嚴重的毒副作用[1-2],尤其對造血功能的損害較大,我國已于2002年全面禁止氯霉素及其鹽和酯類藥物在食用動物上的使用,美國、歐盟等多個國家也禁止氯霉素在食用動物飼養和治療過程中使用與添加[3-4]。將氯霉素苯環上的硝基基團用甲磺酸基取代,即為甲砜霉素;而氟苯尼考則為甲砜霉素的衍生物。甲砜霉素和氟苯尼考毒副作用小,具有較好的抗菌活性,且價格相對便宜,是自氯霉素禁用以來我國使用較廣泛的抗生素[5-6]。但有研究表明,氟苯尼考和甲砜霉素對動物的免疫系統和胚胎均有一定的毒性作用,同時也具有一定的耐藥性,長期使用仍有危害性[7-9]。雞蛋是人們日常生活中較為常用的食品之一,而蛋雞在飼養過程中,飼養密度大,容易發生疾病,因此在預防和治療蛋雞疾病的過程中,常常濫用抗生素,不遵守休藥期要求使用,極易造成雞蛋中藥物殘留,損害消費者的健康[10]。我國農業部235號文件中附件明確規定[11],雞蛋中氯霉素不得檢出,產蛋雞中氟苯尼考不得檢出。

圖1 氯霉素(A)、氟苯尼考(B)、甲砜霉素(C)的分子結構Fig.1 The molecular structures of chloramphenicol(A),florfenicol(B)and thiamphenicol(C)

目前,我國現行有效的標準體系中,用于檢測雞蛋中氯霉素類抗生素的方法只有一套由山東質量技術監督局2018年頒布的地方標準DB37/T 3118-2018《禽蛋中氯霉素類藥物殘留量的測定 液相色譜法》[12];國內外研究中,檢測雞蛋中酰胺醇類抗生素的方法主要有液相色譜-質譜法(LC-MS)[13-16]、液相色譜法(LC)[17-19]、氣相色譜-質譜法(GC-MS)[20]、氣相色譜法(GC)[21]和酶聯免疫法(ELISA)[22]等。在檢測靈敏度、檢測成本、檢測速度和樣品通道方面,液相色譜法和氣相色譜法均無法與酶聯免疫法相比;而酶聯免疫法雖然具有靈敏度高、測定速度快、成本低等優點,但是由于這三種酰胺醇類抗生素結構相似(圖1),往往會存在交叉反應,容易出現假陽性的結果。根據歐盟委員會2002/657/EC決議[23]規定,作為禁用獸藥的氯霉素其陽性結果必須經過質譜確證,并且禁用的獸藥確證檢測方法必須能提供結構方面的信息,且要達到4個確證點,而液相色譜法、氣相色譜法和酶聯免疫法均滿足不了上述要求,因此,酰胺醇類抗生素的確證檢測方法主要為液相色譜-質譜法和氣相色譜-質譜法。而氣相色譜-質譜法一般常需對樣品進行繁瑣的衍生化處理,液相色譜-質譜法具有高選擇性、高靈敏度等特點,無需對樣品進行衍生化處理,可同時測定多個目標物,彌補了上述方法的諸多不足,因此,選用液相色譜-質譜法來檢測雞蛋中酰胺醇類抗生素。

超高效液相色譜-三重四級桿/復合線性離子阱質譜(QTrap UPLC-MS/MS)具有多反應監測-信息關聯采集-增強子離子掃描(MRM-IDA-EPI)檢測模式,能夠對未知化合物進行雙重定性,大大提高了定性分析的準確度;并且能夠利用高選擇性和高靈敏度的MRM掃描獲得化合物的峰面積信息,對化合物進行定量分析[24-25]。本文旨在建立一套靈敏、可靠的可同時檢測雞蛋中氯霉素、氟苯尼考及甲砜霉素藥物殘留的超高效液相色譜-質譜分析檢測方法,首次結合譜庫檢索比對,對目標物同時做到定性和定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

陰性雞蛋樣品(土雞蛋) 寧波本地超市,約20批次;其他雞蛋 浙江省范圍的市售雞蛋,約200批次;氯霉素(CAP)、氟苯尼考(FF)、甲砜霉素(TAP) 純度均大于99%,Dr.Ehrenstorfer公司;氯霉素-D5(CAP-D5) 純度為99.7%,Bepure公司;乙腈、甲醇、乙酸乙酯 色譜純,德國Merck公司;氨水、正己烷 分析純 國藥集團化學試劑有限公司;實驗用水 超純水器(美國Millipore公司)制備的超純水,電阻率為18.2 MΩ·cm。

Sceix Qtrap 5500液質聯用儀 美國Sceix AB公司;TGL-20M高速臺式冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司;Vortex 3自動漩渦混合器 德國IKA公司;多功能全自動氮吹濃縮儀 Bioyage Sweden AB。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 分別稱取適量的氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素標準物質,用甲醇溶解,配制成10 μg/mL的混合標準儲備液;移取適量的氯霉素-D5,用甲醇配制成100 ng/mL的氯霉素-D5標準儲備液,-20 ℃條件下保存。

1.2.2 樣品前處理 樣品去殼后,勻漿,置于分裝瓶中,-20 ℃保存備用。稱取2.00 g已均質混勻的生雞蛋于聚丙烯離心管中,加入適量氯霉素-D5內標和15 mL乙腈后,渦旋混勻5 min,4000 r/min常溫離心5 min后,取上清液于另一個聚丙烯離心管中,樣品殘渣中再加入15 mL乙腈,重復提取一次,合并上清液。40 ℃水浴中氮吹至干。準確加入3.00 mL水復溶后,加5 mL正己烷,渦旋混勻1 min,3000 r/min常溫離心1 min,取下清液,過0.22 μm濾膜(尼龍66),供液質聯用儀上機。

1.2.3 儀器條件 色譜柱:Phenomenex Kinetex F5色譜柱(100 mm×3.0 mm,2.6 μm);柱溫:40 ℃;流動相:A相為水,B相為乙腈;流速:0.2 mL/min;洗脫梯度程序:0～0.50 min,80%A;0.50～7.00 min,80% A～20% A;7.00～7.01 min,20% A～80% A;7.01～8.00 min,80% A,進樣量為5 μL。

離子源:電噴霧電離(ESI),負離子模式;檢測方式:MRM-IDA(信息依懶性掃描)-EPI(增強子離子掃描)檢測模式;電噴霧電壓(IS):-4500 V;離子源溫度(TEM):500.0 ℃;氣簾氣(CUR):0.27 MPa;輔助氣1:0.34 MPa;輔助氣2:0.34 MPa。碰撞氣:MRM模式-Medium,EPI(增強子離子掃描)模式-High。氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素的采集參數見表1。當MRM信號大于IDA設定閾值400 cps時,啟動線性離子肼的EPI功能,EPI掃描范圍:100～400 Da,掃描速率:10000 Da/s,離子阱掃描步長:0.12 Da。

1.2.4 譜庫的構建及陽性樣品的確證 用蠕動泵連續進樣的方式,以7 μL/min的流速將3種濃度為0.6 mg/L的目標化合物的標準溶液注入ESI離子源中,在負離子檢測方式下進行一級質譜掃描(Q1 SCAN),得到目標化合物母離子;接著在產物離子掃描(Product Ion MS2)的狀態模式下,對目標化合物母離子進行子離子掃描,得到相應的子離子信息;最后在MRM的狀態模式下,優化去簇電壓(DP)和碰撞電壓(CE),具體數據見表1。

表1 氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素保留時間及其質譜參數Table 1 Retention time and MS parameters of chloramphenicol,florfenicol and thiamphenicol

本試驗采用MRM-IDA-EPI-譜庫檢索的模式,利用QTRAP的線性離子阱功能,對目標化合物同時進行定性及定量分析。首先,分別用25、40、55 V這三種碰撞能量對氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素進行EPI掃描,編寫這三種物質的LC-MS/MS譜庫,包括化學名、分子式、分子量、CAS編號等信息;接著對陽性樣品進行MRM-IDA-EPI-譜庫檢索,在MRM獲得化合物的保留時間、峰高、峰面積、離子比率等信息的同時,通過EPI掃描獲得一張二級質譜圖,使用已經建立好的譜庫進行檢索匹配;最后通過fit值(匹配值)、revfit值(反匹配值)和purity值(純度值)的評分綜合對陽性樣品確證,若purity值在60%以上,兩者的相似度較為可信。

1.3 數據處理

采用Analyst及MuliQuantTM軟件進行分析,采用Origin 8.0作圖。

2 結果與分析

2.1 前處理條件優化

雞蛋基質復雜,蛋白質、脂類物質含量較高,在進行前處理時,需要消除這些雜質對目標物的干擾。因此本文將從提取條件、凈化條件和復溶條件這三個方面進行前處理優化。

2.1.1 提取條件(提取劑)的優化 根據目標物特性及相關文獻[26-28],選取比較了氨水含量分別為0、1%、3%、5%、10%(體積分數)的乙腈、乙酸乙酯和甲醇的提取效果(見圖2)。結果顯示,用甲醇及其堿化物作為提取劑時,提取液渾濁、過濾膜困難、回收率不理想,可能是因為甲醇提取出了較多雜質,且雜質不易離心去除,基質抑制效應使得回收率不佳;用乙腈、乙酸乙酯及其堿化物作為提取液時,提取液較澄清,過濾膜輕松,且乙腈回收率最理想,三種目標物均達到了92%以上,可能是因為乙腈不僅是良好的提取劑,而且還是良好的蛋白質沉淀劑,很好地解決了對雞蛋中蛋白質的沉淀及對目標物提取的問題。如圖2所示,氨水的含量對乙腈、乙酸乙酯和甲醇沒有顯著區別,因此在實驗中不考慮加氨水,進一步比較乙腈、乙酸乙酯和甲醇的提取效果,最終確定選取了乙腈作為提取劑。

圖2 不同提取劑對目標物回收率的影響Fig.2 Effect of different extraction solvents on the recoveries of the target compounds

2.1.2 凈化條件的優化 有機溶劑對雞蛋提取時,會有大量脂質及類脂物質被提取出來,因此,凈化過程中需除去這類脂溶性雜質。正己烷是常用的去脂溶劑,比較了提取時加15 mL乙腈飽和正己烷(與提取劑同體積)去脂、復溶時加5 mL正己烷去脂這兩種凈化方法的效果,結果顯示,兩種凈化方法的回收率相似,均在95%～100%之間,因此,從環保、高效的角度考慮,選用復溶時加5 mL正己烷的方法來達到凈化效果。

2.1.3 復溶條件的優化 考慮到復溶液與流動相相似原則[10,13],分別選取了水、20%乙腈水溶液(初始流動相)和乙腈這三種復溶液,復溶體積分別選用1.00、2.00、3.00、4.00 mL,考察這三種復溶液和這四種復溶體積對目標物的回收率(圖3、圖4)、峰形效果以及檢出限的影響。結果顯示,當水作為復溶液時,回收率均在91%～119%之間,符合GB/T 27404-2008[29]中對于回收率的要求,同時峰形效果最佳;而20%乙腈水溶液和乙腈作為復溶液時,回收率偏高,在104%～140%之間,不符合GB/T 27404-2008中對于回收率的要求,同時峰形較寬,可能是因為當水作為復溶液溶解目標物時,減少了對其他脂溶性物質和蛋白質的溶解,減輕了雜質的基質干擾。當復溶體積為3.00和4.00 mL時,回收率較為理想,可能是因為當復溶體積大時,雞蛋的基質效應得到了進一步的緩解;雖然當復溶體積為4.00 mL時的效果也較為理想,但考慮到儀器靈敏度的原因,最終選擇3.00 mL的水作為復溶液。

圖3 不同復溶液對目標物回收率的影響Fig.3 Effect of different dissolved solvents on the recoveries of the target compounds

圖4 不同復溶體積對目標物回收率的影響Fig.4 Effect of different volume of dissolved solvents on the recoveries of the target compounds

2.2 儀器條件優化

2.2.1 色譜條件優化 試驗采用Phenomenex Kinetex F5色譜柱(100 mm×3.0 mm,2.6 μm)對氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素進行分離,通過流動相梯度洗脫,得到了較好的分離效果,三種目標化合物在8 min內即可完成有效分離。同時還比較了不同流動相對氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素分離度、靈敏度及峰形的影響。如圖5所示,水相的酸堿度對于分離度及靈敏度無明顯影響;當用乙腈作為有機相時氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考峰形更好,且負離子模式下常選用乙腈作為有機相。因此采用水-乙腈作為流動相體系。采用上述優化后的實驗條件,分析了陰性加標樣品(雞蛋),可見,目標化合物分離度好,未受樣品基質的干擾。

圖5 陰性加標雞蛋樣品(0.5 μg/kg)中氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素的重構離子色譜圖Fig.5 Reconstituted ion chromatograms of chloramphenicol,florfenicol and thiamphenicol in spiked sample(0.5 μg/kg)注:A、B、C為氯霉素;D、E為氟苯尼考;F、G為甲砜霉素。

2.2.2 譜庫檢索與應用 以氟苯尼考為例,對可疑陽性樣品(雞蛋)進行譜庫比對(見圖6),結果顯示,Fit值、Revfit值和Purity值分別為80.637%、78.227%、66.793%,其中,Purity值大于60%,因此可疑樣品中氟苯尼考陽性。

圖6 氟苯尼考的EPI圖 Fig.6 EPI mass spectrogram of florfenicol注:A為可疑陽性樣品;B為標準品。

2.3 線性方程、相關系數及檢出限

為減少基質對定量測定的影響[30],定量用的標準曲線采用基質標準工作溶液配制標準工作曲線。在陰性組織提取液(雞蛋)中依次添加不同濃度的氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素這三種目標物的標準工作液,分別得到0.03、0.06、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00 μg/L和0.06、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00 μg/L這兩組不同濃度的標準液。氯霉素以目標物的峰面積與內標峰面積的比值為縱坐標(y),對應的質量濃度與內標質量濃度的比值為橫坐標(x);氟苯尼考、甲砜霉素以目標物的峰面積為縱坐標(y),對應的質量濃度(μg/L)為橫坐標(x),分別做線性回歸,求得線性回歸方程和相關系數(r),氯霉素內標法定量,氟苯尼考、甲砜霉素外標法定量。在最低添加水平下,以3倍信噪比結合濃度外推法確定方法檢出限。結果顯示,氯霉素和氟苯尼考在0.03～50.0 μg/L,甲砜霉素在0.06～50.0 μg/L的線性范圍內線性關系良好,相關系數r>0.999,檢出限為0.05～0.10 μg/kg(見表2)。

表2 氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素的線性回歸方程、相關系數、檢出限Table 2 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients(r),limits of detection of chloramphenicol,florfenicol and thiamphenicol

2.4 回收率和精密度

參照GB/T 27404-2008中的要求,對陰性樣品(雞蛋)進行3個水平,每個水平6個平行的加標回收試驗。結果表明,氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素在3個加標水平下,平均回收率為90.1%～120.0%,精密度為4.2%～11.9%(見表3)。

表3 雞蛋樣品中氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素的加標回收率和精密度(n=6)Table 3 Spiked recoveries and RSDs of chloramphenicol,florfenicol and thiamphenicol in eggs(n=6)

2.5 實際樣品檢測

依照本文的研究方法對浙江省市售的200批雞蛋樣品進行檢測,檢測結果表明(表4),200批雞蛋樣品中氯霉素和甲砜霉素均未檢出,有4批樣品中檢測出氟苯尼考,檢出率為2.00%,含量在0.5 μg/kg及以上,說明氟苯尼考在產蛋雞中有違規使用的現象,但是含量相對較低。

表4 市售雞蛋中4批樣品的檢測結果Table 4 Contents of four eggs on sale

3 結論

本文采用乙腈提取、正己烷脫脂的方法對雞蛋樣品進行前處理,建立了雞蛋樣品中酰胺醇類抗生素的超高效液相色譜-串聯質譜結合譜庫檢索的快速檢測確證方法。該方法簡便、高效、靈敏,能對酰胺醇類藥物定量的同時,又可以雙重定性,大大提高了檢測的準確性,可用于實際雞蛋樣品檢測。