氣相色譜檢測啤酒中十六種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留方法的建立

柴宗龍,錢瀅文,袁彩霞,洪 霞,何海寧,王杰斌,張彥軍

(1.甘肅省商業(yè)科技研究所有限公司,甘肅蘭州 730010;2.甘肅中商食品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測有限公司,甘肅蘭州 730010)

有機(jī)磷是結(jié)構(gòu)中含有酯鍵的一類化合物,因其種類多、易降解、殘留時間短而廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物病蟲害防治中,其特點(diǎn)主要是高效性和廣譜性[1-2]。有機(jī)磷通過機(jī)體乙酰膽堿途徑引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂,導(dǎo)致機(jī)體無法正常運(yùn)轉(zhuǎn);有機(jī)磷化合物也可通過非膽堿酯酶抑制機(jī)制影響機(jī)體的神經(jīng)系統(tǒng),使機(jī)體產(chǎn)生認(rèn)知功能障礙[3-4]。雖然大多數(shù)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留期短、殘留量少,但是有少數(shù)具有高毒和劇毒特性,如甲胺磷、對硫磷、甲拌磷等。馬雯等[5]研究表明,長期接觸低劑量的有機(jī)磷化合物會對人體產(chǎn)生生殖毒害和致癌的危害。因此,避免有機(jī)磷農(nóng)藥對機(jī)體健康的危害至關(guān)重要。

啤酒是世界上僅次于水和茶的第三大飲料[6-9]。啤酒的生產(chǎn)過程是以大麥、玉米等糧食作物為主要原料,加入啤酒花作為輔料,經(jīng)過酵母發(fā)酵釀制而成[10-12]。Tomonori等[13]和Simn等[14]在文章中指出,加入啤酒花的啤酒中農(nóng)藥殘留量顯著高于未加入啤酒花的啤酒,說明啤酒中的農(nóng)殘有來自于輔料中殘留。由于在啤酒釀造過程中原料和輔料中殘留的農(nóng)藥難以徹底清洗干凈,部分農(nóng)藥有存在于啤酒中的風(fēng)險[15-18],對消費(fèi)者的身體健康造成直接或潛在的危害[19]。因此,加強(qiáng)對啤酒中農(nóng)藥殘留的檢測具有重要意義。

目前,國內(nèi)外有機(jī)磷農(nóng)殘檢測方法有氣相色譜法(Gas Chromatography,GC)、高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(Gas Chromatography-Mass Spectrometry,GC-MS)、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry LC-MS)[20-22]。對于HPLC法,大多數(shù)有機(jī)磷化合物對紫外光吸收不強(qiáng),靈敏度不高,因此該方法對有機(jī)磷農(nóng)殘檢測種類有較大限制,制約了其應(yīng)用;GC-MS法和HPLC-MS法在檢測有機(jī)磷農(nóng)殘時準(zhǔn)確度和靈敏度都能夠滿足,但是其儀器昂貴,成本較高,且需要非常專業(yè)的人員維護(hù),也不宜應(yīng)用于基層企業(yè)。基于此,針對大多數(shù)有機(jī)磷化合物的性質(zhì),其受熱易氣化、熱穩(wěn)定性好,適用于GC法檢測,且GC法前處理操作簡便,分析速度快、靈敏度高[23-24],滿足市場上農(nóng)藥殘留的監(jiān)督檢測。啤酒中無機(jī)化合物成分較為單一,有機(jī)磷化合物在弱酸性環(huán)境中穩(wěn)定性良好[25-27],因此本方法用酸化乙腈提取啤酒中的有機(jī)磷化合物,過針孔濾膜后GC法測定,以期探索一種前處理操作簡單、試劑消耗量少、回收率好的檢測方法,應(yīng)用于市場上不同品類啤酒中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

16種有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品:敵敵畏、滅線磷、甲拌磷、特丁硫磷、二嗪磷、樂果、甲基毒死蜱、甲基對硫磷、毒死蜱、對硫磷、水胺硫磷、甲基異柳磷、丙溴磷、甲基硫環(huán)磷、硫環(huán)磷、三唑磷 純度均≥96%,天津阿爾塔科技有限公司;乙腈、乙酸乙酯 色譜純,北京百靈威科技有限公司;冰乙酸 色譜純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;丙酮 色譜純,西隴科學(xué)股份有限公司;二氯甲烷 色譜純,山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司;氯化鈉、無水硫酸鈉 分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠;啤酒試樣 購自當(dāng)?shù)厥袌觥?/p>

7890B氣相色譜儀,配FPD檢測器 安捷倫科技有限公司;WondaCAP 17色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm) 日本島津技邇(上海)商貿(mào)有限公司;YP402N電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;CF16RXⅡ低溫冷凍高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;VG3S25渦旋振蕩器 北京東方開物科學(xué)器材有限公司;SB25-12D超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;KYC-100B空氣恒溫?fù)u床 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 前處理方法 取出冷藏保存的啤酒試樣,倒適量于大燒杯中,放至于500 W的超聲波儀超聲10 min,以除去二氧化碳。量筒量取5 mL試樣于50 mL聚丙烯刻度離心管中,準(zhǔn)確加入10 mL 1%酸化乙腈(V冰乙酸∶V乙腈=1∶99),超聲提取10 min,期間在超聲波清洗機(jī)中放入冰袋,控制水溫不高于40 ℃,為使農(nóng)藥提取更完全,360 r/min搖床再提取20 min;加入4 g氯化鈉,渦旋0.5 min,3000 r/min離心30 s;取上層有機(jī)相通過填有1 cm高的無水硫酸鈉注射筒和0.22 μm有機(jī)尼龍針式濾器至進(jìn)樣瓶,待GC分析。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制 準(zhǔn)確吸取一定體積的16種有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品,用1%酸化乙腈稀釋于10 mL容量瓶中,各個農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備液濃度為1.00 mg/L,于-4 ℃冰箱中儲存,用1.2.1方法處理的陰性啤酒樣液配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,濃度依次為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15 mg/L。

1.2.3 色譜條件 色譜柱:WondaCAP 17(30 m×0.32 mm×0.25 μm);程序升溫條件:100 ℃保持2 min,25 ℃/min升至150 ℃,8 ℃/min升至240 ℃,保持5 min;載氣:N2(純度99.999%),流量:3.5 mL/min(恒流模式);燃?xì)?H2(純度99.999%);進(jìn)樣口溫度:220 ℃;進(jìn)樣方式:不分流進(jìn)樣,進(jìn)樣量:1 μL;檢測器溫度:250 ℃。

1.2.4 準(zhǔn)確度與精密度 在陰性啤酒試樣中加三個不同濃度水平的16種有機(jī)磷混標(biāo),每個濃度水平做三個平行,用1.2.1處理加標(biāo)試樣后上機(jī)測試,計算其平均回收率和RSD。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Execl計算測試數(shù)據(jù)平均回收率和RSD,用GraphPad Prism 5軟件生成測試數(shù)據(jù)的平面柱形圖和標(biāo)準(zhǔn)偏差(Standard Deviation,SD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 啤酒基質(zhì)中16種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留混標(biāo)色譜譜圖

用1.2.2處理的陰性啤酒樣液按1.2.3配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,在1.2.4氣相色譜條件下上機(jī)測試,得到16種有機(jī)磷農(nóng)藥混標(biāo)色譜譜圖,如圖1所示。

圖1 啤酒基質(zhì)中16種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留混標(biāo)氣相色譜譜圖Fig.1 Mixed standard gas chromatogram of16 kinds of OPs pesticide residues in beer注:1:敵敵畏；2:滅線磷;3:甲拌磷;4:特丁硫磷;5:二嗪磷;6:樂果;7:甲基毒死蜱;8:甲基對硫磷;9:毒死蜱;10:對硫磷;11:水胺硫磷;12:甲基異柳磷;13:丙溴磷;14:甲基硫環(huán)磷;15:硫環(huán)磷;16:三唑磷。

2.2 試樣前處理優(yōu)化

2.2.1 提取試劑的選擇 按1.2.1,在陰性啤酒試樣中外部加標(biāo),使得上機(jī)樣液濃度為0.03 mg/L,考察丙酮、乙腈、乙酸乙酯和二氯甲烷四者的提取效果。如圖2所示,不同有機(jī)磷化合物在氣相色譜FPD檢測器峰面積大小可知,乙腈作為提取試劑,16種有機(jī)磷農(nóng)藥在氣相色譜儀器上響應(yīng)最好。丙酮作為提取溶劑,有機(jī)磷農(nóng)藥整體響應(yīng)沒有乙腈好,而且丙酮提取基質(zhì)中的糖類和色素比較多,容易堵塞進(jìn)樣口;乙酸乙酯作為提取溶劑,提取的脂溶性雜質(zhì)比較多,進(jìn)樣后對色譜柱損耗較大;二氯甲烷是非水溶性的,提取效果不是很理想;相比前三者,乙腈作為提取溶劑避免了提取到過多的糖類、色素和脂溶性化合物,且水溶性良好,更適用于啤酒中有機(jī)磷農(nóng)藥的提取。

圖2 啤酒中16種有機(jī)磷農(nóng)藥分別經(jīng)乙腈、丙酮、乙酸乙酯和二氯甲烷提取上機(jī)檢測響應(yīng)值Fig.2 The response values of 16 kinds of OPs pesticides in beer were extracted by acetonitrile,acetone,ethyl acetate and dichloromethane

2.2.2 乙腈的酸化 按1.2.1處理方法,在陰性啤酒試樣中外部加標(biāo),使得上機(jī)樣液濃度為0.03 mg/L,考察不同酸化程度的乙腈對有機(jī)磷化合物的提取效果。相較于中性環(huán)境,在弱酸性介質(zhì)中,有機(jī)磷化合物的降解速率更慢、穩(wěn)定性更好;如果酸性太強(qiáng),化合物在分離檢測過程中,其無機(jī)酸不易氣化,易附著于氣相色譜儀進(jìn)樣口和色譜柱固定相上,對其有不同程度的損壞并減短使用壽命,尤其是色譜柱。由圖3知,隨著乙酸量的增加,有機(jī)磷回收率增加,但是乙酸量超過1.0%后,回收率不但無明顯增加,反而有些有機(jī)磷的回收率下降了,因此選擇乙酸量為1.0%的乙腈作為啤酒中有機(jī)磷農(nóng)殘?zhí)崛∪軇?并且經(jīng)過多次進(jìn)樣未發(fā)現(xiàn)對進(jìn)樣口和色譜柱有損壞。

圖3 不同酸化程度的乙腈提取啤酒中16種有機(jī)磷農(nóng)藥回收率Fig.3 The recovery rate of 16 kinds of OPs pesticides from beer by acetonitrile extraction with different acidification degrees

2.2.3 酸化乙腈加入量的選擇 按1.2.1方法,在陰性啤酒試樣中外部加標(biāo),使得上機(jī)樣液濃度為0.03 mg/L,考察1%酸化乙腈不同加入量的提取效果。分別用5、8、10、15、20 mL的酸化乙腈進(jìn)行提取,由圖4知,加入10 mL酸化乙腈提取時,16種有機(jī)磷回收率72.33%～108.67%,可適用于啤酒樣品中有機(jī)磷的檢測;用5和8 mL酸化乙腈提取有機(jī)磷農(nóng)藥時,樂果、丙溴磷和甲基硫環(huán)磷的回收率低;用15和20 mL酸化乙腈提取有機(jī)磷農(nóng)藥時,16種有機(jī)磷農(nóng)藥回收率較10 mL提取沒有明顯提高;因此,取5 mL啤酒試樣分析時,最佳條件為10 mL 1%酸化乙腈。

2.3 線性范圍和檢出限

按1.2.2方法配制16種有機(jī)磷農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,在氣相色譜儀平衡至基線穩(wěn)定后,進(jìn)一針溶劑空白,以檢測目標(biāo)物的儀器方法運(yùn)行30 min,以3倍信噪比的峰面積分別帶入不同化合物校正曲線,求得儀器檢出限,10倍信噪比為儀器定量限;將儀器檢出限和定量限按1.2.1處理過程推導(dǎo)出該檢測方法的檢出限和定量限(見表1)。

由表1可知,本檢測方法16種有機(jī)磷農(nóng)藥化合物在啤酒中的檢出限為0.0040～0.0190 mg/L,定量限為0.0132～0.0627 mg/L。

圖4 不同體積的1%酸化乙腈提取啤酒中16種有機(jī)磷農(nóng)藥回收率Fig.4 The recovery rate of 16 kinds of extraction of OPs pesticides from beer by 1% acidified acetonitrile with different volumes

表1 16種有機(jī)磷線性方程和相關(guān)系數(shù)Table 1 16 Kinds of linear equations of OPs and coefficients

2.4 加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)

按1.2.4方法,試樣加標(biāo)濃度水平分別為0.03、0.05和0.08 mg/L,每個濃度水平做六個平行樣,用1.2.1處理后上機(jī)測試,結(jié)果見表2。

表2 16種有機(jī)磷回收率和RSD Table 2 Recovery rates and relative standard deviations of 16 kinds of OPs

由表2可知,啤酒中添加三個濃度水平的16種有機(jī)磷農(nóng)藥化合物,其回收率在72.33%～113.00%之間,RSD在0.52%～9.92%之間,依據(jù)GB/T 27404-2008附錄F,其回收率和RSD均符合要求,能夠滿足啤酒中以上16種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測。

2.5 實(shí)際樣品檢測

在市場上隨機(jī)購買十種不同種類的啤酒,按1.2.1處理后上氣相色譜儀檢測,檢測結(jié)果見表3。

表3 實(shí)樣測試結(jié)果Table 3 Test results of actual samples

通過查閱食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《GB 2763-2016食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[28]知,啤酒產(chǎn)品以及其以上16種有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測暫無檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn);因此,本方法的建立在10種啤酒實(shí)際樣品的檢測中(表3),未檢出以上有機(jī)磷農(nóng)藥。

3 結(jié)論

在5 mL陰性啤酒中外部加標(biāo),用10 mL 1%酸化乙腈提取后上機(jī)檢測,通過分析知該檢測方法操作過程簡單、試劑使用量小,線性范圍0.01～10.0 mg/L,檢出限0.0040～0.0190 mg/L,定量限0.0132～0.0627 mg/L,檢測范圍能夠滿足啤酒中以上16中有機(jī)磷農(nóng)殘的檢測;方法回收率較高,在72.33～113.00%,RSD在0.52～9.92%,檢測數(shù)據(jù)穩(wěn)定性好;實(shí)際樣品檢測結(jié)果均為未檢出;因此,該檢測方法適合于市售啤酒中以上16種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測。