耐熱白樺莖葉高效再生體系的建立

黃曉旭

（河北農(nóng)業(yè)大學園林與旅游學院，河北 保定071001）

白樺（Betula platyphylla）為樺樹科、樺樹屬落葉喬木。高海拔樹種，是荒山荒地、采伐跡地和火燒跡地的先鋒樹種，是溫帶闊葉林和闊葉混交林的主要樹種，具有耐寒性強、適應(yīng)性好、生長速度快等優(yōu)點，姿態(tài)瀟灑、樹干通直、樹皮潔白雅致、枝葉扶疏，秋葉金黃，引人注目[1-2]。耐熱白樺（Heat-resistant Betula platyphylla）是白樺的一個耐熱型品種，由東北林業(yè)大學利用歐洲白樺和黑龍江白樺雜交而得，通過由北京市園林科研所、北京七彩園林工程有限公司等單位引種證明，耐熱白樺可以在北京生長良好[3]。近幾十年來，樺木屬植物的組織培養(yǎng)研究取得了較大的進展，關(guān)于白樺、光皮樺、歐洲白樺、歐洲垂枝樺、西南樺等的植株再生研究相繼得到報道[4]。例如，東北林業(yè)大學在1998年就開展白樺組織培養(yǎng)再生體系的研究；Leena 等人對垂枝樺（Betula pendula）組織低溫保存后的再生植株與原植物的遺傳保真度進行了比較[5]；Lu-Min VAARIO 等人開展日本樺樹組培體系的研究[6]；黑龍江省林產(chǎn)工業(yè)研究所于2018年展開了沼澤小葉樺（Betula microphylla Bunge var.paludosa）的研究[7]。但國內(nèi)關(guān)于耐熱型白樺組織培養(yǎng)快繁育苗的研究尚未見報道。本研究中利用植物組織培養(yǎng)的方法進行耐熱白樺苗木快速繁殖的研究，獲得了完整的再生植株，并實現(xiàn)了再生植株的移栽，對于推動耐熱白樺在華北地區(qū)的應(yīng)用，具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

研究材料為河北省林業(yè)和草原科學研究院栽植的耐熱白樺3年生苗木，引種于山東。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體選擇

外植體選取生長正常、無病蟲害的耐熱白樺幼葉和莖段。

1.2.1 外植體消毒

先用75%的酒精，分別浸泡20s、30s、40s，以無菌水沖洗2～3 次；再用2%次氯酸鈉溶液分別浸泡8min、9min、10min，最后用無菌水沖洗3～5 次。培養(yǎng)后隨時統(tǒng)計污染情況，培養(yǎng)20 d 統(tǒng)計存活率。

1.2.2 分化培養(yǎng)

采用MS、和WPM 作為基本分化培養(yǎng)基，分別加入不同濃度的6-BA 和IBA。培養(yǎng)條件：溫度24 ℃，室內(nèi)相對濕度30%，每天16 h（6：00－22：00）光照培養(yǎng)。接種后觀察愈傷組織增殖和生長狀況，培養(yǎng)第25 d 統(tǒng)計分化芽數(shù)。具體培養(yǎng)基見表1。

表1 耐熱白樺分化培養(yǎng)基類型和激素配比

1.2.3 生根培養(yǎng)

采用1/2MS、MS 和WPM 作為基本分化培養(yǎng)基，分別加入不同濃度的IBA，接種后觀察生根情況，培養(yǎng)第20d 統(tǒng)計生根條數(shù)。具體培養(yǎng)基見表2。

表2 耐熱白樺生根培養(yǎng)基類型和激素濃度

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗結(jié)果的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)用統(tǒng)計匯總后，利用統(tǒng)計分析軟件對試驗數(shù)據(jù)進行多重比較分析、方差等分析。

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 外植體最佳消毒方法

由表3 可見，酒精處理時間對組培苗褐化的影響較大，其中，浸泡20s、30s 的褐化率沒有顯著差異，處理40s，葉子褐化率顯著增大；次氯酸鈉處理時間，則對組培苗長菌率影響較大，浸泡8min、9min 的處理結(jié)果沒有顯著差異，浸泡10min 的葉子生菌率大大降低。因此，最佳耐熱白樺的外植體消毒以浸泡75%酒精溶液中30s，無菌水沖洗2～3 次，再用2%次氯酸鈉溶液浸泡10min，最后用無菌水沖洗3～5 次為宜。

表3 外植體消毒處理結(jié)果

2.2 分化培養(yǎng)基篩選

表4 分化培養(yǎng)基篩選結(jié)果

葉片分化效率最高的培養(yǎng)基為：wpm+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA，分化效率達94%（表4），葉片5 天開始膨大形成愈傷組織，25 天左右分化出叢生芽；莖段最佳分化培養(yǎng)基為：MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA，分化效率達92%，7 天開始膨大形成愈傷組織，25 天左右分化出叢生芽。

2.3 生根培養(yǎng)基篩選

再生芽長至1cm 左右時接種至生根培養(yǎng)基培養(yǎng)。耐熱白樺初代生根選用1/2ms+0.2 mg/L IBA 培養(yǎng)基最好，接種后5 d 開始生根，生根率96.7%，繼代生根用wpm+0.3 mg/L IBA 培養(yǎng)基最好，接種后7 d開始生根，生根率100%。

表5 生根培養(yǎng)基篩選結(jié)果

3 結(jié)論與討論

在植物器官離體組織培養(yǎng)的條件下，不同植物組織對營養(yǎng)要求不同，甚至同一植物不同部位的組織對營養(yǎng)的要求也不同[5]。培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是植物組織培養(yǎng)能否獲得成功的重要因素之一[6]。本研究從外植體消毒、分化培養(yǎng)基的篩選、生根培養(yǎng)基的篩選三個方面，試驗總結(jié)出耐熱白樺最優(yōu)組織培養(yǎng)步驟，即：外植體浸泡于75%酒精溶液中30s，以無菌水沖洗2～3 次，再用2%次氯酸鈉溶液浸泡10min，最后用無菌水沖洗3～5 次；葉片分化培養(yǎng)基選擇WPM+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA，莖段分化培養(yǎng)基選擇MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA；生根培養(yǎng)基最佳選擇為：初代生根用1/2MS+0.2 mg/L IBA 培養(yǎng)基最好，繼代生根用WPM+0.3 mg/L IBA 培養(yǎng)基。

組織培養(yǎng)過程中會發(fā)生基因大片段丟失的情況，這也是創(chuàng)制新種質(zhì)的方法。在本次試驗中，耐熱白樺的組培苗出現(xiàn)了花葉、白化葉突變體，因漲勢較弱未能成功轉(zhuǎn)化為白樺新品系，但此突變材料可作為直接研究色素代謝，光合作用以及激素合成等通路分子機理的重要植物材料。項目組下一步工作重點將以此為出發(fā)點，著重開展利用組織培養(yǎng)創(chuàng)制白樺新種質(zhì)的工作。