超低溫保存對胡楊種子活力及生理指標的影響研究

劉艷萍 朱中原 劉濤陽

摘 要 胡楊種子在自然狀態下極易失活，因此建立適合胡楊種子的保存方法十分必要。而超低溫可以實現種子的長期保存。基于此，用硅膠對胡楊種子進行脫水處理，使種子的含水量形成不同梯度，再對不同含水量的種子進行超低溫保存，然后對保存后的種子進行化凍處理，確定種子的存活率，測定種子的各種生理生化指標。實驗結果表明，含水量是影響胡楊種子存活的重要因素，含水量為4.30%時胡楊種子的發芽率較高。影響胡楊種子的另外一個重要因素是化凍方法，采用快速化凍方法胡楊種子具有較高的存活率，且各種酶活性及種子的電導率、丙二醛含量都較低。對含水量為4.30%的胡楊種子進行超低溫保存后，快速化凍對胡楊種子傷害較小，且對各種生理生化指標影響較小，適合胡楊種子超低溫保存。

關鍵詞 胡楊種子;超低溫保存;種子活力;生理指標

中圖分類號：S792.11 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.14.071

胡楊屬楊柳科落葉喬木，主要分布在中亞、西亞和地中海地區，在我國荒漠區有大面積天然分布，是生長于極端干旱荒漠區的唯一優勢成林樹種，但由于自然和人為因素的影響，胡楊面臨瀕危，并被列為我國三級重點保護植物。胡楊種子成熟后在自然狀態下生命力在30 d

內就幾乎完全喪失，且種子萌發成苗過程中會遭受氣候、地下水位、土壤含水量和土壤鹽漬化等外界環境因素的干擾。如何讓胡楊種子在逆境脅迫下仍然保持活力，引起了學者的關注。張琴等[1]采用室溫未密封、室溫密封、4 ℃密封三種方式貯藏胡楊種子，測定種子劣變過程中的活力變化指標，結果表明，隨著貯藏時間延長，種子含水量、發芽率、活力指數逐漸下降，活力下降速度為室溫未密封﹥室溫密封﹥4 ℃密封，三種貯藏方式中，以4 ℃密封貯藏方式效果最好，種子活力最高。張肖等[2]研究了胡楊種子萌發對溫度、光照和鹽旱脅迫的敏感性，結果表明，胡楊種子萌發對溫度、光照不敏感，適宜溫度下萌發快速集中，且萌發時對鹽旱脅迫具有一定的耐性。王海珍等[3]研究了胡楊和灰胡楊種子對不同鹽類的耐受限度和適應萌發生境，結果表明兩種胡楊均具有較強的耐鹽性。伊麗米努爾等[4]研究表明，低濃度鹽對胡楊種子萌發有一定的促進作用，而高鹽濃度下，種子萌發受到明顯抑制。劉艷萍等[5]采用硅膠脫水的方法制備不同含水量的胡楊種子，再經不同相對濕度溶液對種子進行回濕處理，確定了最適含水量及最適回濕方法。張玲等[6]采用包埋玻璃化液氮冷凍法對胡楊休眠莖尖進行冷凍保存，總結出包埋玻璃化法在液氮中保存胡楊的深冬休眠芽是可行的。目前，超低溫保存是實現生物種質資源永久保存的理想方法，被廣泛應用，已成功保存了近300種植物材料[7-8]。國內外超低溫保存實際生產應用主要集中在農作物和蔬菜上，目前也已成功對部分種子、花粉、莖段、懸浮細胞等組織培養物進行了保存試驗[9-11]。

大多數植物材料在超低溫環境中細胞的新陳代謝活動會基本停止，從而使細胞活力能夠得到穩定保存[12]。為了探尋胡楊種子長期低成本保存的新方法，本研究以胡楊種子為材料，對其進行超低溫保存后種子的萌發特性、膜脂過氧化以及抗氧化保護系統研究。通過對不同含水量的胡楊種子進行保存，確定適合的胡楊種子超低溫保存含水量，并對保存后的種子進行化凍處理，測定超低溫保存后的各種生理生化指標，篩選出適合胡楊種子超低溫保存的化凍方法，探究適合胡楊種子超低溫保存的方法，為胡楊資源的永續利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料的采集

于2018年8月在新疆阿拉爾市塔里木大學周邊采集胡楊種子，自然晾干后，用紗網手工揉捏、過篩，剔除雜質，得到所需的種子，保存到4 ℃冰箱里備用。

經測定，所得胡楊種子初始含水量6.06%，發芽率為46.7%。

1.2 硅膠干燥法對胡楊種子的干燥處理

稱取15組胡楊種子，每組7 g，采用硅膠干燥法干燥種子。將稱取好的種子和變色硅膠置于同一干燥器中對胡楊種子進行干燥，變色硅膠和種子質量比為5∶1，干燥時間分別為1 d、2 d、3 d、4 d、5 d。干燥后按時取出種子，將不同含水量的種子密封放置于4℃冰箱保存備用。

1.3 不同化凍方法對胡楊種子的處理

將不同含水量的種子置于液氮中冷凍24 h后，采用兩種不同化凍辦法對種子進行化凍處理，分為兩組：第一組取出后置于25 ℃溫水中快速化凍15 min后置于4 ℃冰箱保存備用;第二組先置于-10 ℃冰箱化凍10 min后置于4 ℃冰箱繼續化凍后保存備用。

1.4 種子含水量測定

采用分析天平隨機稱取1 g鮮種子于玻璃皿中，轉入恒溫烘箱并調節溫度至121 ℃烘干17 h，冷卻至室溫后用分析天平稱取干重，計算種子含水量（重復三次），測出種子初含水量為6.06%。計算公式如下。

1.5 發芽率和發芽指數測定

在培養皿內墊紙4層，用蒸餾水潤濕芽床均勻放置30粒種子，移入人工氣候培養箱，調節溫度至24 ℃左右，設置光照15 h;溫度15 ℃左右，黑暗9 h。分別記錄第2天、第3天、第4天的種子發芽數。計算種子發芽率以及發芽指數，發芽率計算公式見公式（1），發芽指數計算公式見公式（2）。

公式（2）中GI為種子發芽指數，Gt為當天種子發芽數，Dt為種子發芽天數。

1.6 相關生理指標的測定

電導率的測定：隨機稱取1 g胡楊種子，放于燒杯中，倒入50 mL去離子水，用玻璃棒攪拌充分后，在25 ℃條件下靜置1 d，次日再次用玻璃棒攪拌均勻后用電導儀測其浸出液，測出單位質量電導率。

超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用鄰苯三酚自養化法，具體方法參照何樂韻等[13]的研究方法，本次稍有改動。

過氧化物酶（POD）活性測定采用愈創木酚法，過氧化氫酶（CAT）活性測定采用高錳酸鉀滴定法，丙二醛含量（MDA）測定采用硫代巴比妥酸法。可參照劉艷萍等[5]的測定方法，本次稍有改動。

各項指標均設3個重復，每個重復測定3次，求平均值和標準差。

1.7 數據統計分析

采用統計軟件DPS和Excel處理數據。

2 結果與分析

2.1 不同處理對胡楊種子活力的影響

2.1.1 超低溫保存對種子活力的影響

由表1可知，未冷凍處理的種子發芽率受種子含水量影響，隨著含水量的降低，種子發芽率逐漸降低。經液氮超低溫處理后并采用快速化凍方法化凍處理，隨著種子含水量的降低，種子發芽率先升高后降低，當種子含水量在4.30%時，冷凍組種子的發芽率和發芽指數與對照組差異不顯著，但均高于對照組。因此胡楊種子超低溫保存的臨界含水量為4.30%時對種子萌發有一定的促進作用。

2.1.2 不同化凍方法對種子活力的影響

由表2可知，對比采用兩種不同化凍方法對胡楊種子進行化凍處理，其中采用快速化凍方法對胡楊種子進行化凍，種子整體活力水平均高于采用慢速化凍胡楊種子的活力，說明采用快速化凍比慢速化凍對種子造成的傷害小。兩種不同化凍方法處理的胡楊種子，隨著含水量的降低，胡楊種子發芽率和發芽指數均呈現出先升高再降低的趨勢，并且在種子含水量為4.30%時種子活力最高。

2.2 不同處理對胡楊種子膜脂過氧化的影響

2.2.1丙二醛（MDA）含量

丙二醛（MDA）是膜脂過氧化作用最終分解產物，會抑制細胞保護酶的活性，降低抗氧化物含量，可以用來反映膜脂的過氧化程度[14-16]。圖1顯示種子經過液氮超低溫處理后，不論采用何種化凍方式，含水量為4.30%時，種子中丙二醛含量均較低，其他含水量種子MDA含量均有明顯升高，說明在超低溫保存過程中對種子造成了一定傷害，選擇合適含水量對胡楊種子進行超低溫保存是有必要的[5]。

2.2.2 胡楊種子電導率的變化

由圖2可知，經過超低溫處理，且采用快速化凍方法化凍的胡楊種子整體水平電導率明顯低于慢速化凍，并且當胡楊種子含水量在3.66%～5.02%，采用快速化凍種子電導率與對照組電導率相近，且當種子含水量在4.30%時，其電導率達到最低。因此，采用快速化凍方法對種子進行化凍，且含水量應控制在4.30%時，對種子的傷害程度較小。

2.3 不同處理對胡楊種子抗氧化保護系統的影響

2.3.1 過氧化物酶（POD）活性

如圖3所示，隨著種子含水量的降低，采用慢速化凍的種子POD活性上升幅度比采用慢速化凍明顯且在含水量4.30%時達到峰值，接近未處理的種子活性，當含水量低于4.30%時采用慢速化凍的種子POD活性下降程度很大。相對而言，采用快速化凍方法對種子進行化凍，對種子POD活性影響不大。

2.3.2 超氧化物歧化酶（SOD）活性

超氧化物歧化酶（SOD）可以催化超氧化物歧化反應[17]，是活性氧清除體系中第一個發揮作用的抗氧化酶。植物在低溫寒冷等逆境脅迫下會產生對細胞有害的活性氧和自由基，SOD通過催化歧化反應使活性氧生成過氧化氫和氫氣，減輕細胞活性氧傷害。由圖4可知，經超低溫處理后無論采用何種化凍方式，不同含水量的胡楊種子超氧化物歧化酶活性均有所下降，說明超低溫冷凍處理對種子具有一定的傷害。相對而言，采用快速化凍方法對種子進行化凍比慢速化凍傷害小。不同含水量種子的超氧化物歧化酶活性也不同，在含水量4.30%時其活性最高。

2.3.3 過氧化氫酶（CAT）活性

過氧化氫酶（CAT）是植物體內與抗性相關的酶，不僅可以保護生物膜，還可以促進種子代謝，增加種子的抗逆性。采用快速化凍的種子和慢速化凍種子CAT活性均隨含水量的降低呈先上升后下降的趨勢，但采用快速化凍的種子CAT活性始終高于慢速化凍（圖5）。因此，采用快速化凍的方法對種子進行化凍優于慢速化凍。

3 結論與討論

超低溫冷凍過程中，種子的含水量是影響其生命力的一個關鍵因素。理論上講，含水量過高會使種子在冷凍和解凍過程中受到傷害甚至死亡，過低又會造成脫水傷害影響其活力[17]。種子發芽率和發芽指數是反映種子活力的綜合指標，未冷凍處理的種子發芽率受種子含水量影響，隨著含水量的降低種子發芽率逐漸降低。經超低溫處理后并采用快速化凍方法化凍，隨含水量降低，種子發芽率先升高后降低，在快速化凍種子含水量達到4.30%時，其發芽率和發芽指數均高于對照組，且采用快速化凍方法對胡楊種子進行化凍其活力整體水平均高于采用慢速化凍后胡楊種子的活力。說明超低溫保存對胡楊種子萌發有促進作用，且胡楊種子超低溫保存的臨界含水量為4.30%。同時，快速化凍方法對胡楊種子進行化凍減少了對種子的傷害，可使種子保持較好的活力。

植物在逆境或衰老過程中，細胞內自由基代謝的平衡被破壞，有利于自由基產生，自由基過剩會引發或加劇膜脂過氧化，造成細胞膜系統損傷，導致細胞膜透性增大，同時使膜脂過氧化的產物MDA含量增加，而MDA是膜脂過氧化作用的最終產物，是膜系統受傷害的重要標志[18]。當細胞原生質膜受到破壞時，膜透性就會增加，細胞內部物質外滲，導致相對電導率增加，相對電導率反映了外滲程度和膜受損傷的程度[19]。本研究中，對胡楊種子進行超低溫處理，采用快速化凍方法化凍胡楊種子，當種子含水量在4.30%時，對胡楊種子的傷害最小，說明在超低溫保存過程中對種子造成了一定的傷害，當含水量降至4.30%時，MDA含量與對照組無差異，說明適宜的含水量可以緩解低溫處理對細胞膜的傷害。

過氧化物酶（POD）是植物種子重要的保護酶，為植物細胞提供高效專一的活性氧清除體系，其活性與植物種子的超低溫耐性相關[20]。植物在低溫寒冷等逆境脅迫下會產生對細胞有害的活性氧和自由基，超氧化物歧化酶（SOD）通過催化歧化反應使活性氧生成過氧化氫和氫氣，減輕細胞活性氧傷害。過氧化氫酶（CAT）是植物體內與抗性相關的酶類，不僅可以保護生物膜，還可以促進種子代謝，從而增加種子的抗逆性。

比較慢速化凍和快速化凍兩種方法化凍后胡楊種子的抗氧化保護系統發現，快速化凍的種子POD、SOD、CAT活性指標均高于慢速化凍的種子的相應指標，說明快速化凍的種子這幾種酶組成了完整的防氧鏈條，能夠降低細胞膜脂過氧化，保持細胞膜的完整性，減緩低溫對植物種子的傷害，促進種子在低溫脅迫后萌發。環境脅迫破壞了植物體自由基的產生和清除之間的平衡，會導致自由基在植物體內積累，造成膜脂過氧化作用，對植物造成損傷[21- 22]，因此采用慢速化凍的方法，對胡楊種子細胞膜造成損傷較重，這與宋紅[23]超低溫保存玉蟬花（Iris ensata）種子生理生化研究結果一致。

綜上，胡楊種子不僅要在合適含水量范圍內，還要采用合適的化凍方法對超低溫冷凍處理后的種子進行化凍，才能有效減少超低溫保存過程中對種子造成的傷害。超低溫保存后，快速化凍對胡楊種子傷害較小，適度降低胡楊種子含水量可以提高超低溫保存后種子的發芽率，最適含水量為4.30%。

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（責任編輯：趙中正）