乳源外泌體的組成及其生物功能研究進展

仝令君，郝海寧，張蘭威，易華西*

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003）

哺乳動物母乳作為幼體的主要營養來源，含有蛋白質、乳糖、脂肪、維生素、礦物質等多種營養素以及神經元生長因子、生長調節因子、免疫相關因子等重要生理活性物質[1-2]，對新生兒的生長發育和免疫系統的形成具有重要作用[3-5]。外泌體作為母乳的成分之一，能夠攜帶和傳遞重要的信號分子，其信號分子的特性與宿主細胞的生理狀態密切相關，目前已經成為國內外的研究熱點。外泌體是一種能被大多數細胞分泌的微小膜泡，具有脂質雙層膜結構，直徑大約30～200 nm，存在于絕大多數真核生物的體液中，包括血液、尿液、唾液、腦脊液以及乳液中[6-7]。外泌體的概念最早在1983年被提出，但一直被認為只是細胞的廢棄物，近幾年研究發現在外泌體中含有細胞特異的蛋白質、脂質和核酸，能作為信號分子傳遞給其他細胞從而改變其他細胞的功能[8-9]。母乳是一種豐富的外泌體來源，初乳中外泌體濃度遠高于成熟乳[10]。乳源外泌體無論在疾病診斷方面，還是在嬰幼兒生長發育方面，都具有重要的研究價值。目前國外關于牛乳外泌體、人乳外泌體等乳源外泌體的功能研究報道較多[9,11]。研究表明，乳源外泌體不僅具有作為藥物運輸載體、疾病篩查標志物的潛力，還有望被研制開發為一種新型的益生元[12-13]，但我國有關外泌體的研究還處于起步階段。據此，本文綜述了乳源外泌體的組成、功能和應用前景，旨在為我國乳源外泌體的研究與開發提供思路。

1 外泌體的形成途徑

外泌體是細胞內多泡體與細胞膜融合后釋放到胞外基質中的一種膜性囊泡。目前認為外泌體的形成途徑有兩種（圖1）。第一種為外泌體形成的經典途徑（圖1a）。首先，細胞內形成包含有蛋白質和RNA等胞內生物分子的神經酰胺依賴性晚期囊泡，在神經酰胺的作用下，囊泡中的內容物避開溶酶體的消化[14]；然后這些囊泡融合到胞內形成的多胞體（multivesicular body，MVBS）中，接著MVBS被整合到質膜上，并將外泌體（囊泡）釋放到細胞外基質中[15]。蛋白質和RNA等內容物在外泌體形成過程中被分選并載入外泌體，整個過程中涉及了20多種囊泡分選蛋白，其中最重要的是內體運輸分揀復合物（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）和液泡蛋白分選因子（vacuolar protein soaing 4，Vps4）。ESCRT為細胞膜塑形蛋白，可以介導內吞囊泡出芽，加速腔內囊泡的形成；Vps4可以重新塑造ESCRT再生，便于其循環再利用。ESCRT和Vps4在外泌體形成、載體蛋白分揀過程中起著不可或缺的作用[16-18]。隨著研究的深入，發現外泌體形成除“經典途徑”外，還存在第二種更為直接的形成途徑（圖1b）。T細胞和紅白血病細胞系直接從其質膜釋放外泌體。人類免疫缺陷病毒的Gag或Nef蛋白在T細胞、紅細胞和白細胞表達后，這3 種細胞的細胞膜發生內陷，形成并釋放外泌體[19-21]。這些小泡與經典途徑形成的外泌體難以區分，也富含CD63和CD81等經典外泌體標記物，其直徑和密度與外泌體也極為相似，目前這種形成途徑的機制尚不清楚。有研究報道指出，乳源外泌體主要來自乳腺上皮細胞，其生物發生是通過細胞質膜內囊泡的向內出芽（內吞）來啟動的（外泌體形成的經典途徑），隨后生物發生繼續隨著晚期內吞體限制膜的內陷形成多泡體并將“貨物”分選到這些多泡體內，接著形成腔內囊泡并被整合到質膜上，最后以外泌體（囊泡）的形式出芽[13,22]。

圖1 外泌體形成的兩種途徑Fig. 1 Two pathways of exosome formation

2 乳源外泌體的結構與組成

外泌體是具有脂質雙層膜結構的膜外小泡，其具有與細胞相同的拓撲結構，直徑約為30～200 nm。不同方法測得的外泌體大小存在一定差異，即使是單個細胞分泌的外泌體也是如此。每種外泌體測定技術都會引入相應的誤差范圍進行校正。通過透射電子顯微鏡、原子力顯微鏡或者冷凍電子顯微鏡對外泌體的結構進行表征，幾乎所有表征都顯示出簡單的球狀形態。大約一半數量的外泌體直徑都在預期的30～200 nm直徑范圍內，其余顯示為直徑較大的微泡。此外，極少數外泌體呈現不尋常的膜狀結構，甚至具有其他不規則的形態[23]。這些不規則的結構可能與外泌體形成過程中某個定向生物過程有關，但是外泌體提取過程中的物理機械壓力也可能是導致這些結構形變的主要原因[24]。

圖2 外泌體結構Fig. 2 Structure of exosome

外泌體主要的組成部分是蛋白質、核酸、脂質。如圖2所示，外泌體由雙層磷脂膜包裹，含有較高水平的膽固醇、鞘磷脂、神經酰胺以及短/長鏈飽和脂肪酸[25-26]。不同細胞來源的外泌體，雖然組成存在不同程度的差異，但其表面都具有相似的保守蛋白，如CD63、CD81、CD9等。這些標志蛋白在外泌體分離鑒定過程中具有重要靶標作用。此外，不同來源的外泌體蛋白組成存在一定差異，腸上皮細胞來源的外泌體含有特異性A33抗原，而免疫B細胞外泌體中富集有CD86和組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）。不同動物乳外泌體中含有多種可調節細胞免疫功能的蛋白質，如載脂蛋白、白細胞介素（interleukin，IL）-19等[27]。Théry等[28]從樹突狀細胞來源的外泌體中共檢測到21 種蛋白質；Merchant等[29]從人體尿液外泌體中檢測到43 種蛋白質；Reinhardt等[30]從牛乳外泌體中共檢測到2 107 種蛋白質；Yang Mei等[27]從母乳和牛乳不同泌乳期樣品中一共鑒定出920 種外泌體蛋白。上述研究表明，相較于其他體液，牛乳和母乳中外泌體蛋白的含量更為豐富。母乳外泌體中含有豐富的免疫相關蛋白、轉運相關蛋白、參與核糖體途徑的蛋白以及肌動蛋白細胞骨架調節蛋白。這些蛋白在嬰幼兒免疫調節[31]、細胞間傳導[32]、蛋白質合成、mRNA翻譯[33]以及肌動蛋白相關細胞調節[34]中起著至關重要的作用。

核酸是外泌體中的另外一種主要組分，對外泌體發揮生理功能具有重要意義。乳源外泌體中核酸主要包括非編碼單鏈RNA 分子（microRNA）、長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）、環狀RNA（circular RNA，circRNA）、mRNA、tRNA等[35-36]。序列同源性分析表明，microRNA約占乳源外泌體平均RNA含量的13%[37]。microRNA是由約70 nt的長莖環前體衍生而來的約22 個核苷酸非編碼小RNA，已成為基因表達中關鍵的轉錄后調控因子，在宿主生理和病理過程中發揮重要作用[38]。乳源外泌體microRNA也可以進入人體循環并調節外周血細胞中的基因表達[39]。與成熟乳相比，初乳的外泌體中含有豐度更高的免疫相關microRNA[40]。lncRNA是一類轉錄本長度超過200 nt、非編碼蛋白的RNA。lncRNA能在表觀遺傳、轉錄及轉錄后水平上調控基因表達。近期研究發現lncRNA存在于生物體液中，一部分lncRNA游離于體液中，一部分被包裹在外泌體中進行遠距離的信息傳遞[41]。CircRNA是一類特殊的非編碼RNA分子，也是RNA領域最新的研究熱點。與傳統的線性RNA（含5’和3’末端）不同，CircRNA分子呈封閉環狀結構，不受RNA外切酶影響，表達更穩定，不易降解。研究發現外泌體CircRNA能夠通過遠距離的信號傳遞來調節受體細胞內的生物功能[42]。核小RNA（small nuclear RNA，snRNA）在前體RNA的剪接中發揮作用，而核仁小RNA（small nucleolar RNA，snoRNA）主要指導rRNA、tRNA和snRNA的修飾[13]。由于脂質雙層膜的保護作用，乳源外泌體中核酸在低pH值、高溫和酶處理等條件下非常穩定[43]，為其進入人體循環并發揮功能提供了基礎。

3 乳源外泌體的生物學功能

3.1 乳源外泌體與腸道發育

腸道不僅是營養物質消化吸收的主要部位，也是重要的免疫器官和內分泌器官[44]。在新生兒腸道中，營養運輸沿著整個隱窩-絨毛軸線發生[45]。胃腸道作為負責將營養物質運送到身體細胞的第一個生理器官，在調節嬰幼兒發育和健康方面發揮著重要作用[46]。乳源外泌體在嬰幼兒腸道發育方面具有重要作用[47-49]。乳源外泌體耐受核糖核酸酶消化，并不受凍融循環和酸度的影響，允許外泌體內容物完整地到達新生兒的腸腔并被吸收[48]。Wolf等[50]研究表明，腸道對牛乳外泌體的攝取是通過內吞作用及膜融合作用來介導的，并依賴于腸道中的細胞和外泌體表面糖蛋白，而腸道對牛乳外泌體中microRNA的吸收途徑主要是在頂端到基底外側方向的單向過程。Chen Ting等[49]研究表明，豬乳來源的外泌體可以促進豬小腸細胞增殖和腸道發育，并提高豬小腸細胞中尾側型同源盒基因-2（caudal-related homeobox gene 2，CDX2）、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、胰島素樣生長因子1受體（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R）基因的表達以及抑制p53抑癌基因（tumor suppressor gene p53，p53）的表達。CDX2是腸道特異性轉錄因子，在整個腸道上皮細胞核中表達，直接參與腸發育、腸表型的保持和維持[51]。PCNA與細胞周期相關，并在DNA復制和修復中起作用[52]。已有報道PCNA免疫定位可用作正常組織和淋巴樣腫瘤中細胞增殖的指標[53]。IGF-1R下游Akt/Wnt信號通路在細胞增殖中起關鍵作用。此外，豬乳來源的外泌體可以顯著增加小鼠十二指腸和空腸的絨毛高度和隱窩深度，從而提高絨毛高度（villus height，V）與隱窩深度（crypt depth，C）的比值。目前認為V/C越高，表明腸道發育以及免疫功能越好，營養物質更易被吸收[54]。Hock等[55]指出，小鼠（母）乳來源的外泌體可以促使PCNA基因相對表達顯著增加，從而提高小鼠腸上皮細胞活力，促進細胞增殖，刺激腸干細胞活性。乳源外泌體可以在腸系統內“行進”并被Lgr5＋干細胞攝取，上調Lgr5基因表達，提高腸道上皮細胞的活力[55]，并通過上調腸道CDX2、PCNA、IGF-1R基因的表達，促進腸道細胞增殖，從而促進嬰幼兒腸道發育[49]。乳源性外泌體還參與母乳介導的抑制Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）4表達，從而保護腸上皮免受細胞凋亡和增強腸上皮細胞增殖，并在腸杯狀細胞分化中起作用，防止過度炎癥，并維持腸上皮完整[48]。此外，飲用牛奶后，會在人體血漿和肝臟中檢測出牛乳外泌體中特異性microRNA，表明來自動物源食物中的microRNA可以通過腸道上皮組織進入人體循環，對于人類的營養和健康具有非常重要的意義[56]。Wang Yanhong等[57]研究發現，由于CircRNA比線性RNA更穩定，因此在膳食乳外泌體中攜帶的circRNA有更多機會進入體內組織并發揮特定的生物學功能。例如，衍生自染色質重塑基因ARID1A反義RNA的CircRNA59（在乳源外泌體中含量高）也在小鼠和人組織中表達。ARID1A促進心臟祖細胞分化，抑制子宮上皮細胞增殖[58]。ARID1A損傷可重塑染色質，并在多種肝損傷后改善再生[59]。

外泌體如何介導新生兒腸道發育是目前的研究熱點，也是研究難點。母乳外泌體可以將蛋白質、核酸等轉運到新生兒的腸道系統，保護其免受酸度降解和消化，并使其保持結構完整及被吸收[48]，這是乳源外泌體可以刺激腸道發育最為關鍵的一步。Good等[60]研究報道，TLR4的激活參與壞死性小腸結腸炎（necrotizing enterocolitis，NEC）的發生與進程，但母乳中的表皮生長因子可以抑制TLR4信號的傳導，抑制NEC的發生，從而保護腸上皮細胞免于凋亡并促進腸細胞增殖。母乳來源的外泌體是否通過運輸表皮生長因子到達腸道，參與抑制TLR4信號的傳導，促進腸細胞增殖，這有待進一步深入研究。Pieters等[61]研究表明，乳源外泌體中富含轉化生長因子β（transforming growth factor beta，TGF-β），其在嬰兒時期對腸屏障功能的發育、免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）A的產生以及黏膜免疫起著重要的作用。此外，幾種母乳外泌體microRNA已被證明在腸道杯狀細胞分化中具有預防過度炎癥、保持腸上皮完整的功能[48,62-64]。Ma Jideng等[65]指出大熊貓初乳和成熟乳外泌體中富含與免疫和腸道發育相關的內源性microRNA，如let-7家族、ame-miR-148a-3p、ame-miR-30a-5p等。乳源外泌體中miR-135b-5p和miR-664b-3p也可以分別通過靶向肌肉萎縮相關蛋白MEF2C和PLP2促進腸道細胞增殖[66-67]。Kosaka等[62]發現乳源外泌體中的miR-223可以作為腸道嗜中性粒細胞增殖和活化的調節劑，而let-7i作為TLR4的調節劑，在NEC中可以抑制TLR4信號的傳導，保護腸上皮細胞免于凋亡并促進腸細胞增殖。近年來，腸道微生物已經被證明對宿主具有重要生理調節功能，關于母乳外泌體對腸道微生物組成是否具有調控作用、是否可以通過調節腸道菌群介導新生兒腸道發育的研究報道較少，是值得深入研究的方向之一。

3.2 乳源外泌體的免疫功能

母乳是一種具有免疫細胞的復雜液體，可為嬰幼兒提供免疫因子，影響嬰幼兒免疫系統的發育與成熟。母乳外泌體攜帶抗原結構，表明其能夠參與指導免疫反應。研究發現，母乳外泌體可以抑制抗分化簇3誘導的來自異源和同源外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中的IL-2和干擾素-γ的產生。另外，在乳源外泌體培養的PBMC中，外泌體中MHC II與CD86的表達對CD4＋T細胞具有刺激作用，從而促使調節性T細胞（regulatory cell，Treg）Foxp3＋、CD4＋、CD25＋數量增加，表明母乳外泌體具有免疫調節能力[32]。母乳是嬰幼兒重要的免疫支持系統，乳源外泌體在嬰兒免疫系統中具有雙重功能，外泌體能夠參與嬰幼兒免疫刺激[68]和耐受[69]，發揮類似益生元的功能，為研究與開發乳源外泌體這一新型益生元奠定了理論基礎。

Zhou Qi等[8]對母乳外泌體中的microRNA組成和轉錄組學進行了研究，發現高特異性microRNA占所有microRNA數量的62.3%。通過Pathway Central分析，有4 種前體microRNA與免疫相關，分別為miR-148a-3p、miR-30b-5p、miR-182-5p、miR-200a-3p。miR-30b-5p促進細胞侵襲和免疫抑制[70]，miR-182-5p由IL-2誘導，能促進T細胞介導的免疫應答[71]，miR-200a-3p與霍奇金淋巴瘤和口腔癌癥相關[72-73]，miR-148a-3p調節誘導多種轉運蛋白和藥物代謝酶表達[74-75]。miR-148a-3p在牛奶中高度表達，被認為是可作為識別牛奶和其他乳的潛在生物標志物[76]。Ma Jideng等[65]對大熊貓不同哺乳期中母乳外泌體及外泌體中的microRNA進行了表達特征分析，發現大熊貓初乳和成熟母乳中富集有與免疫和發育相關的內源性microRNA。研究結果表明，大熊貓母乳中外泌體microRNA可能是新生大熊貓幼崽發育的關鍵母體“調節者”。Zeng Bin等[77]通過RNA測序對牛乳外泌體中的lncRNA進行了全面分析，研究表明，從牛乳外泌體中共鑒定出3 475 個新的lncRNA和6 個可注釋的lncRNA。lncRNA表達量比mRNA更高。基因本體（gene ontology，GO）注釋和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）途徑分析表明，lncRNA具有調節免疫功能，促進成骨細胞生成、神經發育、繁殖、細胞增殖和細胞間通訊等方面的功能。此外，L?nnerdal等[78]發現母乳外泌體中與免疫功能相關的高豐度microRNA為miR-146、miR-181、miR-21、miR-16和let-7，而Zhou Qi等[8]研究發現豐度前10的microRNA中，其中與免疫相關的4 個高豐度microRNA為miR-148a-3p、miR-30b-5p、miR-182-5p、miR-200a-3p。上述研究結果存在一定差異，表明乳源外泌體microRNA對免疫功能的影響還需進一步深入系統研究。

流行病學研究發現，嬰兒出生的第一年進行牛乳飲食可以防止特應性疾病的發展，增加Treg的數量[79]。牛乳外泌體來源的microRNA可能通過促進T細胞下調IL-4/輔助性T細胞（IL-4/T helper 2 cell，IL-4/Th2），也可能通過誘導胸腺Treg譜系所需的關鍵免疫調節因子和表觀遺傳修飾因子來介導特應性致敏作用和免疫應答[40]。牛乳外泌體中miR-155與免疫系統的發育密切相關，控制參與調節FoxP3（Treg的標志性分子）表達、IL-4信號轉導和免疫球蛋白類轉換為IgE和IgE的高親和力受體——關鍵靶基因FcεRI的表達[80]。這些研究都表明乳源外泌體在免疫調節中可能具有不可或缺的作用。然而，加熱及均質處理對牛乳外泌體microRNA介導的生物活性具有負面影響[46]。加熱及均質處理是乳制品加工中不可缺少的操作單元，嬰幼兒配方奶粉由于缺失了具有生物活性的外泌體microRNA，從而影響FoxP3表達[76]。在奶粉噴霧干燥后期通過干混加入牛乳外泌體能夠避免上述影響，最大程度地保護牛乳外泌體microRNA的生理活性。

3.3 乳源外泌體在炎癥預防方面的作用

炎癥反應是臨床常見的病理反應，可以在機體各部分的組織和器官中發生。發掘新型對機體炎癥適度調節的天然功能成分對預防及治療由宿主異常炎癥反應造成的健康隱患具有重要意義。研究表明，免疫細胞可能通過分泌外泌體介導炎癥[81-82]。來源于紅細胞、間充質干細胞和支氣管肺泡灌洗液的外泌體已被證明具有促進促炎細胞因子產生的作用[83-85]。體液來源的外泌體可以通過TLR-2和TLR-4激活核因子κB信號通路，導致促炎細胞因子mRNA和蛋白水平升高[86]。然而，這些來源的外泌體由于獲取比較困難，其作為調節機體炎癥的天然功能成分具有一定局限性。牛乳是大規模生產外泌體的可靠來源[87]。最近研究表明，乳源外泌體在改善關節炎方面具有一定作用[9]。類風濕關節炎是炎癥反應的一種，其發展與遺傳和環境因素有關，一些研究表明與生活方式和飲食因素（主要是牛乳的攝入量）有關，其發病機制可能是這些因素會通過影響調節T細胞應答來促使類風濕關節炎的發展[88]。Arntz等[9]研究了牛乳外泌體對小鼠關節炎的影響，對兩種T細胞依賴的慢性和破壞性關節炎模型小鼠灌胃乳源外泌體，結果發現兩種老鼠的關節炎明顯減輕，同時由脾細胞產生的單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）和IL-6的血清水平降低，表明口服外泌體可改善實驗性關節炎。牛乳外泌體中還包含許多具有免疫調節作用的microRNA和lncRNA[40,76-77]，例如直接靶向MCP-1 mRNA的miR-124a[89-90]、靶向TLR/IL-1炎癥途徑的miR-21、miR-let7、miR-146a、miR-146b、miR-126、miR-155、miR-199a[91-92]，以及靶向miR-146a-5p的lncRNA核內小RNA宿主基因16（lncRNA SNHG16）[93]，這些microRNA和lncRNA都可能在炎癥預防方面發揮重要作用。除了核酸之外，牛乳囊泡中存在的一些蛋白質也發揮抗炎作用，如乳鐵蛋白、載脂蛋白E和TGF-β[93-96]。上述研究為開發乳源外泌體作為口服益生元提供了理論依據。

3.4 乳源外泌體的其他生物學功能

Oliveira等[97]指出向小鼠口服遞送乳源外泌體能促進其骨細胞數量以及編織骨形成，從而促進成骨細胞分化和骨基質形成。同時研究發現口服遞送外泌體后，能夠促進成骨細胞分化和小破骨細胞的形成，但會減少骨吸收和骨連接蛋白的表達，并抑制結節的形成，導致骨基質質量受到損害[98]。因此，乳源外泌體可能作為調節成骨細胞和破骨細胞分化的骨調節劑，在嬰幼兒骨發育方面發揮一定的作用。此外，有研究發現乳源外泌體對小鼠骨骼肌基因表達、生殖能力以及空間學習與記憶能力都有一定的影響[99-101]。Leiferman等[99]指出，乳源外泌體可以顯著提高骨骼肌發育相關基因Rhobtb1和Socs2的表達，對年輕成年小鼠骨骼肌中的基因表達和代謝略有影響。Mutai等[100]研究發現，與飼喂外泌體組相比，未飼喂外泌體的小鼠在Barnes迷宮中定位逃生洞所需的時間延長了130%，定位和到達Morris水迷宮中的水下逃生平臺所需的時間明顯延長。Sadri等[101]研究表明，雄/雌兩者均飼喂乳源外泌體的小鼠平均產仔數是均不飼喂外泌體組的兩倍。如果至少有一只小鼠不飼喂外泌體，62%～75%的交配不會導致懷孕。上述研究成果為乳源外泌體的生物學功能及其作為新型益生元的研究與開發提供了新思路。

4 結 語

外泌體是在細胞間和細胞內通訊過程中具有多種功能的納米級囊泡，攜帶有蛋白質、核酸等含有豐富生物學信息的生物分子。目前對外泌體的研究主要集中在兩個方面：一方面是以外泌體作為癌癥等疾病篩查或診斷的標識物，期望開發出基于外泌體的疾病快速活檢技術；另外一方面是利用外泌體的穩定性和傳輸性，以牛乳外泌體作為藥物載體，攜帶藥物用于疾病的靶向治療。但是對人體母乳、牛乳等乳源外泌體生理功能方面的深入研究較少。已有的基礎研究表明，乳源外泌體具有調節免疫、預防炎癥、促進生長發育等多方面的生理功能，具有益生元的開發潛能。隨著對乳源外泌體生理功能及其機制的深入研究，乳源外泌體有望作為一種新型的益生元，在嬰幼兒配方奶粉、功能型飲料等功能食品的研究與開發中發揮重要作用。