2-巰基苯并噻唑熒光增敏法檢測(cè)過(guò)氧化氫含量及過(guò)氧化氫酶活力

呂雅娟，袁瑞青，李志英*

（1.山西醫(yī)科大學(xué) 汾陽(yáng)學(xué)院，山西 汾陽(yáng) 032200；2.忻州師范學(xué)院 化學(xué)系，山西 忻州 034000）

過(guò)氧化氫是公認(rèn)的低毒物質(zhì)，可用作漂白劑、消毒劑、脫氧劑，也可作食品添加劑。植物在自身代謝中產(chǎn)生過(guò)氧化氫（H2O2）需及時(shí)清除，否則對(duì)植物細(xì)胞產(chǎn)生危害。而植物中也存在過(guò)氧化氫酶，它能催化過(guò)氧化氫分解[1]，起清除過(guò)氧化氫的作用。過(guò)氧化氫酶（CAT）活性的測(cè)定在此之前已有不少報(bào)道，如：熒光分析法[2]、水楊酸法[3]、分光光度法[4]、Warburg法[5]、鉬酸銨法[6]等。這些方法要推廣應(yīng)用存在一定的局限性，如操作繁瑣、工作量大、儀器設(shè)備昂貴、測(cè)定體系復(fù)雜等問(wèn)題，在實(shí)際應(yīng)用中受到限制。而利用熒光分析法測(cè)定過(guò)氧化氫酶的活性報(bào)道較少，因此，研究一種測(cè)定蔬菜水果中過(guò)氧化氫酶活性的方法是非常必要的。

2-巰基苯并噻唑是是一種化學(xué)分析的試劑，分子式是C7H5NS2，可作為通用型硫化促進(jìn)劑，廣泛用于各種橡膠制品，也可與1-氨基-4-硝基蒽醌和碳酸鉀可制得染料分散艷紅S-GL，這種染料用于滌綸及其混紡織物的染色。2-巰基苯并噻唑用作電鍍添加劑時(shí)又稱酸性鍍銅光亮劑M，在以硫酸銅為主鹽的光亮鍍銅時(shí)作為鋪助光亮劑。此外，該品還用于制取農(nóng)藥殺真菌劑、氮肥增效劑、切消油和潤(rùn)滑添加劑、照相化學(xué)中的有機(jī)防灰化劑、金屬腐蝕抑制劑等[7]，是一種非常重要的化學(xué)物質(zhì)。

研究發(fā)現(xiàn)，在堿性條件下，2-巰基苯并噻唑幾乎不發(fā)熒光，但加入H2O2后發(fā)生氧化反應(yīng)使其熒光增強(qiáng)，蔬菜中提取的過(guò)氧化氫酶催化H2O2分解為H2O和O2，短時(shí)間內(nèi)使得熒光強(qiáng)度減弱。因此，用2-巰基苯并噻唑-NaOH熒光增敏法檢測(cè)過(guò)氧化氫的含量，并用過(guò)氧化氫含量的減少檢測(cè)過(guò)氧化氫酶活性，此方法環(huán)保，操作簡(jiǎn)單方便。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

RF-5301PC熒光分光光度計(jì)，蘇州島津公司。

0.029 mol/L 過(guò)氧化氫溶液：取3 mL30%的過(guò)氧化氫(天津市福晨化學(xué)試劑廠，分析純)于100 mL的容量瓶中定容配制成0.29 mol/L的貯備液，用高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)定，在2～8 ℃冰箱中避光保存，用時(shí)可稀釋為0.029 mol/L 的工作液；氫氧化鈉（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，分析純）；0.01 mol/L 2-巰基苯并噻唑溶液：準(zhǔn)確稱取0.1673 g 2-巰基苯并噻唑（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，分析純）于100 mL干燥的燒杯中，移取10 mL1.00 mol/L的氫氧化鈉溶液溶解，蒸餾水定容到100 mL的容量瓶中，得0.01 mol/L溶液；新鮮的土豆、黃瓜、生菜均購(gòu)于忻州師范學(xué)院西巷平價(jià)超市。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 過(guò)氧化氫含量的檢測(cè)方法

取兩支25 mL 的比色管，各加入0.01 mol/L 2-巰基苯并噻唑溶液1 mL，其中一支再加入1 mL 的0.029 mol/L H2O2定容至25 mL，在已設(shè)定為55 ℃的水浴鍋中加熱30 min，流水冷卻5 min，在激發(fā)波長(zhǎng)342 nm、發(fā)射波長(zhǎng)430 nm處，測(cè)定熒光強(qiáng)度。不加過(guò)氧化氫溶液的熒光強(qiáng)度記為F，加入過(guò)氧化氫的溶液熒光強(qiáng)度記為F0，并計(jì)算熒光強(qiáng)度變化ΔF（ΔF=F0-F）。

1.2.2 過(guò)氧化氫酶的提取[8]

將被測(cè)的新鮮蔬菜樣品稱量后置于研缽中，加入少量石英砂和適量蒸餾水，充分研磨成勻漿后，轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶?jī)?nèi)，并用蒸餾水將研缽沖洗3～4次，洗滌液轉(zhuǎn)入容量瓶中，定容到刻度線，混勻后在5 ℃冰箱內(nèi)靜置10 min。將研磨液轉(zhuǎn)入幾個(gè)10 mL塑料離心管中，在4000 r/min下離心15 min，上清液即為過(guò)氧化氫酶粗提液，于5 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定

取兩支25 mL 的比色管，各加入H2O2溶液1 mL，其中一支加入過(guò)氧化氫酶提取液1 mL，在25 ℃的水浴下反應(yīng)不同時(shí)間，充分振蕩后，各加入1 mL 2-巰基苯并噻唑，定容到25 mL，在55 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min后用流水冷卻5 min，測(cè)定熒光強(qiáng)度，計(jì)算熒光強(qiáng)度變化△F 及過(guò)氧化氫酶活。酶活計(jì)算公式[9]：C=25[(ΔF-77.26）/6.69]/t。式中，C為CAT活性，mol/min；t為反應(yīng)時(shí)間，min。

2 結(jié)果與討論

2.1 測(cè)定體系的熒光圖譜

取兩支25 mL 的比色管，各加入0.01 mol/L 2-巰基苯并噻唑溶液1 mL，其中一支再加入0.029 mol/L H2O25 mL定容至25 mL，在已設(shè)定為55 ℃的水浴鍋中加熱30 min，流水冷卻5 min，在激發(fā)波長(zhǎng)342 nm，測(cè)定熒光強(qiáng)度F和F0，并計(jì)算△F（△F=F0-F），結(jié)果如圖1。從圖1可以看出，2-巰基苯并噻唑在430 nm處有弱熒光，加入H2O2熒光增強(qiáng)。

圖1 2-巰基苯并噻唑與H2O2熒光光譜圖Figure 1 Fluorescence spectra of 2-mercaptobenzothiazole and H2O2

2.2 pH、溫度、加熱時(shí)間對(duì)測(cè)定體系的影響

在其它實(shí)驗(yàn)條件不變的情況下，按實(shí)驗(yàn)方法1.2.1用NaOH 和HCl調(diào)節(jié)溶液的pH分別為4、5、6、7、8、9、10、11、12，測(cè)定其熒光強(qiáng)度，并計(jì)算ΔF（ΔF=F0-F），結(jié)果如圖2（A）。由圖2（A）可知，酸性條件下熒光較弱，原因是2-巰基苯并噻唑在堿性條件才能溶解，但堿性太強(qiáng)H2O2不穩(wěn)定，所以，pH=7～8時(shí)效果最好，而用酸度計(jì)測(cè)定體系的pH=7.5，加入H2O2也不會(huì)小于7，所以選擇不加緩沖溶液。

配制同濃度的2-巰基苯并噻唑、2-巰基苯并噻唑+H2O2，在其它實(shí)驗(yàn)條件不變的情況下，按照1.2.1分別考察了反應(yīng)溫度分別為35、45、55、65、75 ℃，反應(yīng)時(shí)間分別為10、20、30、40、50、60 min 熒光強(qiáng)度的變化（ΔF=F0-F），結(jié)果如圖2（B）、（C）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：溫度對(duì)反應(yīng)影響很大，ΔF值隨加熱溫度的升高逐漸增加，但溫度過(guò)高過(guò)氧化氫分解，溫度為55 ℃最佳。加熱時(shí)間30 min后基本穩(wěn)定，因此選擇加熱時(shí)間30 min。

圖2 pH（A）溫度（B）和加熱時(shí)間（C）對(duì)熒光強(qiáng)度ΔF的影響Figure 2 Effect of pH（A）,temperature（B）and（C）time on fluorescence intensity △F

2.4 工作曲線與檢出限

取25 mL 比色管，每支加入1 mL 2-巰基苯并噻唑溶液，再分別加入0.15、0.2、0.4、0.6、0.8、2、4、6、8、10 mL 的1 mol/L H2O2溶液，定容至25 mL，在55 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min，用流水冷卻5 min，測(cè)定熒光強(qiáng)度，并作出工作曲線（圖3）。求得回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為：ΔF=6.69 c+67.26（mmol/L），r=0.9962，過(guò)氧化氫濃度在0.23～116 mmol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。平行測(cè)定11次不加過(guò)氧化氫的空白溶液，求得其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Sr）為1.45%，檢出限為6.73×10-5mol/L。

2.5 過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定

圖3 過(guò)氧化氫的工作曲線Figure 3 Working curve of hydrogen peroxide

各取5 kg潔凈的土豆、生菜、黃瓜，按照1.2.2的方法提取過(guò)氧化氫酶，采用1.2.3的方法測(cè)定酶活，結(jié)果如表1，土豆、生菜、黃瓜過(guò)氧化氫酶活力分別為0.018、0.012、0.010 mol/min，表明蔬菜中過(guò)氧化氫酶活強(qiáng)度大小順序?yàn)橥炼梗旧耍军S瓜。

表1 過(guò)氧化氫酶活的測(cè)定Tab.1 Determination of catalase activity

3 結(jié)論

利用2-巰基苯并噻唑-NaOH熒光增敏法測(cè)定過(guò)氧化氫含量,反應(yīng)最佳溫度為55 ℃，加熱時(shí)間為30 min。在此基礎(chǔ)上對(duì)三種蔬菜（土豆、生菜、黃瓜）中提取的過(guò)氧化氫酶活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示蔬菜中過(guò)氧化氫酶活性強(qiáng)弱順序?yàn)橥炼梗旧耍军S瓜。與其他參考文獻(xiàn)結(jié)果相比[9]，本方法簡(jiǎn)單、方便，不受環(huán)境影響。