DLL3沉默抑制小細胞肺癌細胞系H592的增殖和遷移

周菁， 郭麗

(1. 陜西省腫瘤醫院腫瘤科， 陜西 西安 710061； 2. 空軍第九八六醫院干部病房科， 陜西 西安 710054)

小細胞肺癌(small cell lung carcinomas, SCLC)是肺癌的一個亞型，約占肺癌的15%，但其5年生存率僅有1%～2%，明顯低于其他類型的肺癌[1]。因此，探討SCLC轉移的分子機制對于預防其復發至關重要。近年來，眾多學者對SCLC的病理機制進行了深入探究，并開發了多種治療SCLC的靶向藥物，主要針對Notch信號通路、酪氨酸激酶受體、免疫檢查點、凋亡信號通路等相關的靶點[2]。

Notch信號通路激活后可以抑制SCLC癌細胞的增殖與轉移。DLL3作為Notch家族的一員，可以抑制Notch信號通路的激活[3]。研究表明，DLL3在SCLC細胞表面呈高度上調，一項臨床報道發現83%的SCLC腫瘤患者DLL3呈陽性，其中32%高表達，這表明DLL3可能是治療該疾病的潛在靶點[4]。目前關于DLL3在SCLC發生、發展中的作用機制研究并不多，最近有報道稱DLL3通過調控上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相關蛋白Snail促進癌細胞的遷移和侵襲[5]。本研究通過收集SCLC患者的臨床信息，分析DLL3在癌組織與癌旁組織中的表達，并探討DLL3促進SCLC轉移的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織來源 收集陜西省腫瘤醫院2017年1月至2018年12月手術切除的SCLC組織及其癌旁組織50例，所有病例經病理學確診。本研究經由陜西省腫瘤醫院倫理委員會批準。

1.1.2 試劑 RPMI-1640培養基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素(美國Gibco公司)；SCLC細胞系H592、正常支氣管上皮細胞HBE(廣州吉妮歐生物科技有限公司)；DLL3，MUC-1, Snail, GAPDH抗體(英國Abcam公司)；Transwell小室(美國Corning公司)；CCK-8試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；凋亡檢測Annexin V FITC-PI試劑盒(北京欣博盛生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 H592和HBE均培養于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，并加入終濃度為1%的青霉素和鏈霉素，置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。

1.2.2 免疫組織化學法檢測組織中DLL3的表達 組織切片采用二甲苯脫蠟，乙醇脫水，高pH抗原修復液修復抗原。自然冷卻后，取出切片，PBS緩沖液沖洗3次，3%過氧化氫封閉30 min，用EDTA抗原提取緩沖液在微波爐中加熱切片進行抗原提取。室溫下，將切片用10%的山羊血清封閉30 min。加入一抗DLL3抗體4 ℃孵育過夜；滴加HRP偶聯的二抗，37 ℃孵育30 min；PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復染。根據陽性染色細胞比例及染色強度進行打分，將患者分為低表達DLL3(≤3分)組和高表達DLL3(>3分)組。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測DLL3、MUC-1的mRNA表達 從獲取的SCLC組織以及癌旁組織提取RNA，采用RNAprep Pure動物組織總RNA提取試劑盒提取RNA。從處于對數生長期的SCLC細胞系H592中提取RNA，采用RNAprep Pure培養細胞總RNA提取試劑盒提取總RNA。測量D(260 nm/280 nm)評估RNA的質量。取1 μg RNA作為模板，采用FastKing一步法逆轉錄-熒光定量試劑盒檢測DLL3 mRNA水平，以GAPDH作為內參。反應條件：95 ℃ 3 min預變性；95 ℃ 15 s, 60 ℃ 30 s, 35個循環。DLL3上游引物：5′-CACTCCCGGATGCACTCAAC-3′；下游引物：5′-GATTCCAATCTACGGACGAGC-3′。MUC-1上游引物：TGCCGCCGAAAGAACTACG；下游引物：TGGGGTACTCGCTCATAGGAT。GAPDH上游引物： 5′-CTGACTTCAACAGCGACACC-3′；下游引物：5′-TGCTGTAGCCAAATTCGTTG-3′。每組實驗設置3個復孔。

1.2.4 蛋白質印跡檢測DLL3、MUC-1、Snail蛋白的表達水平 收集H592細胞，加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min。12 000 r/min、4 ℃離心20 min。取上清液采用BCA試劑盒進行蛋白定量分析。每組取50 μg蛋白上樣于SDS-PAGE膠上，160 V運行1 h。隨后采用濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜上。5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗DLL3(1 ∶2 000)，MUC-1 (1 ∶ 1 000), Snail (1 ∶ 1 000), GAPDH (1 ∶ 5 000) 4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，二抗室溫孵育2 h。ECL發光液曝光、顯影。

1.2.5 細胞轉染 將H592細胞按照2×105個/孔的密度接種到6孔板中，孵育24 h。采用脂質體LipofectamineTM3000將si-NC、si-DLL3、si-MUC-1轉染至H592細胞，操作過程按照說明書進行。轉染成功48 h后，收集細胞進行后續實驗。

1.2.6 CCK-8實驗檢測細胞增殖 取處于對數生長期的H592細胞100 μL接種于96孔板中，孵育過夜。向每孔加入10 μL的CCK-8溶液進行增殖實驗檢測。采用酶標儀測定450 nm處的光密度。測量時間點為0、12、24、48 h。

1.2.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡 收集轉染48 h后的H592細胞用于流式細胞儀檢測。500 r/min離心5 min收集H592細胞，PBS重懸；加入3 μL Annexin-V-FITC，輕輕混勻后加入終濃度為1 μg/mL的碘化丙啶，4 ℃避光孵育10 min。離心后100 μL PBS重懸，進行流式細胞儀檢測。

1.2.8 Transwell實驗檢測細胞遷移 將H592細胞以5×104的密度接種于不含血清的RPMI-1640培養基中，取300 μL加入到Transwell小室上層，下層加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基。孵育48 h后，用棉簽將上層小室內的細胞擦去，甲醇和丙酮(1 ∶ 1)固定30 min，結晶紫染色30 min。倒置顯微鏡下觀察細胞遷移數，隨機選取10個視野，取平均值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 DLL3在SCLC組織及癌旁組織中的表達

免疫組織化學染色結果顯示，SCLC組織中DLL3呈現較強的表達，且主要表達于細胞膜上，而癌旁組織中DLL3基本不表達。SCLC組織中DLL3陽性表達率為72%(36/50)，其中高表達的有22%。實時熒光定量PCR結果顯示，癌組織中DLL3的mRNA表達較癌旁組織顯著提高(Z=7.62,P<0.01)。見圖1、圖2。

圖1 免疫組化染色檢測SCLC組織及癌旁組織中DLL3的表達(×200)

圖2 實時定量熒光PCR檢測SCLC組織及癌旁組織中DLL3的表達

2.2 DLL3在SCLC細胞系H592中的表達

蛋白質印跡和實時熒光定量PCR結果顯示，DLL3在H592細胞中的表達水平顯著高于HBE細胞(t=21.63,t=43.62，P均<0.01)，提示DLL3在SCLC中表達上調。見圖3、圖4。

圖3 蛋白質印跡檢測SCLC細胞H592中DLL3的蛋白表達

圖4 實時熒光定量PCR檢測SCLC細胞H592中DLL3的mRNA表達

2.3 下調DLL3抑制H592細胞增殖、促進凋亡

實時熒光定量PCR結果顯示，與si-NC組比較，si-DLL3組DLL3的mRNA表達顯著降低(t=79.95,P<0.01)。提示，si-DLL3組中H592細胞的DLL3基因被抑制，可以進行后續實驗。見圖5。

圖5 siRNA干擾后H592細胞DLL3 mRNA表達

CCK-8檢測H592細胞活力結果顯示，與si-NC組比較，在48 h 時si-DLL3組的細胞活力明顯降低(t=14.07,P<0.01)，而si-NC組與空白對照組間無明顯差異。見圖6。si-DLL3轉染細胞48 h后，流式細胞儀檢測結果顯示，與si-NC相比，si-DLL3組細胞凋亡能力明顯增強(t=133.60,P<0.01)；而si-NC組與空白對照組間無明顯差異。見圖7。

a:P<0.01,與si-NC組比較

圖7 下調DLL3對H592細胞凋亡的影響

2.4 下調DLL3抑制H592細胞遷移

轉染48 h后Transwell實驗結果顯示，si-DLL3組細胞穿膜的垂直遷移能力顯著低于si-NC組，差異有統計學意義(t=7.25,P<0.01)；而si-NC組與空白對照組間無明顯差異。見圖8。

圖8 下調DLL3對H592細胞遷移的影響(結晶紫染色，×100)

2.5 DLL3與MUC-1表達水平呈顯著正相關

蛋白質印跡結果顯示，與si-NC組比較，si-DLL3組MUC-1 mRNA蛋白表達明顯下調(t=36.13,P<0.01)；而Snail蛋白表達無差異(t=0.35,P=0.74)。見圖9。

圖9 蛋白質印跡檢測MUC-1和Snail蛋白的表達

進一步采用實時熒光定量PCR檢測MUC-1 mRNA在SCLC組織及癌旁組織中的表達，結果顯示與癌旁組織相比，癌組織中MUC-1的mRNA表達水平顯著提高(Z=9.63,P<0.01)。見圖10。

圖10 實時熒光定量PCR檢測癌組織及癌旁組織中MUC-1的mRNA表達

Pearson相關性分析顯示，在SCLC癌組織中DLL3與MUC-1的mRNA表達水平呈顯著正相關(r=0.83,P<0.01)。提示DLL3可能通過調控MUC-1促進SCLC的增殖與遷移。見圖11。

圖11 MUC-1與DLL3 mRNA表達的相關性

2.6 下調MUC-1抑制H592細胞增殖、遷移，促進凋亡

實時熒光定量PCR結果顯示，與si-NC組比較，si-MUC-1組MUC-1的mRNA表達顯著降低(t=27.24,P<0.01)。表明si-MUC-1組中MUC-1基因被抑制，可以進行后續實驗。見圖12。CCK-8檢測結果顯示，與si-NC組比較，si-MUC-1組24 h(t=5.81,P<0.05)和48 h(t=6.63,P<0.01)的細胞活力均明顯降低，而si-MUC-1組與空白對照組間無明顯差異。見圖13。流式細胞儀檢測結果顯示，與si-NC組比較，si-MUC-1組細胞凋亡明顯增強，差異有統計學意義(t=21.47,P<0.01)；而si-NC組與對照組間無明顯差異。見圖14。Transwell結果顯示，與si-NC組比較，si-MUC-1組H592細胞遷移能力明顯下降(t=7.58,P<0.01)；而si-NC與對照組間無明顯差異。見圖15。上述結果表明下調MUC-1可以抑制SCLC細胞的增殖、遷移，促進凋亡。

圖12 siRNA干擾后H592細胞MUC-1 mRNA表達

a: P<0.05, b: P<0.01，與si-NC組比較

圖14 下調MUC-1對H592細胞凋亡的影響

圖15 下調MUC-1對H592細胞遷移的影響(結晶紫染色，×100)

3 討論

SCLC是一種惡性腫瘤，具有生長快、轉移早、預后差的特點。目前鉑類藥物是其主要治療藥物，但幾乎所有患者3個月內都會復發。DLL3作為Notch配體抑制劑，在SCLC中通過阻滯Notch信號通路激活來促進癌細胞的增殖擴散。Rova-T是一類靶向DLL3的抗體偶聯藥物，在SCLC治療中展現出一定的抗腫瘤效果[6]。DLL3可能是治療SCLC的靶點，目前關于其在SCLC進展中的分子機制并不明確。

近期有學者指出DLL3高表達的晚期SCLC患者呈現較短的無進展生存期和總生存期；下調DLL3抑制了EMT，導致SCLC細胞的增殖、遷移能力減弱，提示靶向DLL3有助于防止SCLC的轉移[7]。但是由于Notch信號通路在不同的腫瘤類型中發揮不同的作用[8]，DLL3可能根據不同癌癥類型扮演不同的角色，比如在肝癌中發現DLL3啟動子甲基化會促進其細胞凋亡，提示DLL3在肝癌中可能是抑癌基因[9]。本研究證實了DLL3在SCLC癌組織中呈現表達上調，DLL3陽性率為72%，高表達率為22%。DLL3下調后能抑制SCLC細胞H592增殖、遷移，促進細胞凋亡。

最近有研究證實在SCLC中DLL3通過調控Snail來促進癌細胞的增殖、遷移與侵襲[5]。本文也分析了DLL3調控SCLC細胞所介導的信號途徑，發現敲減DLL3前后Snail表達無明顯變化，但與EMT相關的另一個蛋白分子MUC-1的表達出現了明顯變化。表明在該細胞系中DLL3有可能通過調控MUC-1促進EMT進程。MUC-1是黏蛋白家族的一員，其過度表達會促進上皮來源的腫瘤細胞獲得間質細胞的可遷移能力，即促進EMT進程。目前已證實MUC-1在肺癌[10]、乳腺癌[11]、結直腸癌[12]、胰腺癌[13]和多發性骨髓瘤[14]等表達上調，促進癌細胞的轉移。本研究表明，MUC-1在SCLC癌組織中呈高表達，推測在SCLC中DLL3通過調控MUC-1促進EMT進程，從而促進癌細胞的轉移。SCLC患者中MUC-1與DLL3表達水平呈顯著正相關的結果間接證實了我們的推測。進一步敲減MUC-1，結果發現H592細胞的遷移能力明顯降低，表明下調MUC-1可以抑制腫瘤的遷移。

本研究證實了DLL3和MUC-1在SCLC組織中表達上調，敲減DLL3和MUC-1會抑制癌細胞的增殖、遷移，促進凋亡，推測在SCLC中DLL3通過調控MUC-1促進EMT進程，從而促進癌細胞的轉移。