超高效液相色譜-串聯質譜法測定保健食品中90 種那非類藥物

馬俊美,王 敬,孫文毅,蔣 杰,李 強,范素芳

(河北省食品檢驗研究院,河北省食品安全重點實驗室,河北 石家莊 050091)

保健食品能調節人體機能,是對人們正常膳食的有益補充[1],隨著社會經濟的發展和亞健康人群的增加,保健食品市場銷量與日俱增。近年來該行業持續發酵,呈現較為混亂的局面[2],一些不法商家為突出功效,吸引消費者,謀取高額利潤,在產品中非法添加短期內見效快、成本低廉、副作用大的化學藥物[3-4],為消費者的健康埋下了隱患。其中補腎壯陽類保健品是非法添加的重災區,非法添加的壯陽類藥物主要是以西地那非為代表的那非類物質[5-6],該類化合物將給消費者帶來嚴重的健康威脅,產生心律失常、心肌梗死、心臟猝死、腦血管出血、高血壓等嚴重不良反應[7-9],患有高血壓等心血管疾病和糖尿病患者在不知情的情況下服用這些非法添加化學成分的藥物甚至會導致死亡[10]。

目前,保健食品中那非類物質的檢測方法有薄層色譜法[11-12]、液相色譜法[13-16]、液相色譜-高分辨質譜法[17-21]和高效液相色譜-串聯質譜法[22-26]等。其中,薄層色譜法前處理復雜,干擾大且容易出現假陽性;液相色譜法檢測的物質較單一,且檢出限較高。隨著分析檢測技術和分析儀器的不斷發展,具有高選擇性和高靈敏度,且定量準確,操作簡便的高效液相色譜-串聯質譜法得到廣泛應用[27-28],己成為那非類物質的主要檢測方法[29-31]。目前,基于高效液相色譜-串聯質譜法檢測那非類物質的種類較少(30 種以下),不夠全面,檢測30 種以上那非類物質均采用高分辨質譜法,側重于定性篩查[32]。本研究采用超高效液相色譜-串聯質譜法,建立可能被添加的90 種那非類物質的測定方法,該方法前處理簡單、靈敏度高、準確性好,適合大批量樣品中那非類物質的快速測定,不僅為開展食品檢驗工作提供技術支撐,也對打擊制、售假冒偽劣保健食品,凈化保健食品市場產生重要影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

固態和液態保健食品 市售。

甲醇、乙腈、甲酸(均為色譜純) 德國默克公司;超純水 廣州屈臣氏公司;90 種那非類藥物混標(20 μg/mL) 北京曼哈格生物科技有限公司。

Triple Quad 6500+液相色譜-質譜聯用儀(配有電噴霧離子源及MultiQuant3.0.2數據處理系統) 美國Sciex公司;3K13離心機 德國Sigma公司;Vortex Genius 3渦旋儀 德國IKA公司;Elmasonic P300H超聲波清洗器德國Elma公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

固態試樣混勻研細,液態試樣搖勻后,準確稱取1.00 g樣品于25 mL容量瓶中,加入20 mL甲醇,超聲提取15 min,放置室溫后,用甲醇定容,轉移至50 mL離心管中,9 500 r/min離心2 min,上清液經0.22 μm微孔濾膜過濾,取濾液,根據實際濃度用甲醇適當稀釋至線性范圍內,待測。

1.2.2 色譜條件

XBridge BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,2.5 μm);流動相A為0.1%甲酸溶液,B為乙腈;進樣體積5.0 μL;柱溫40 ℃;流速0.3 mL/min;梯度洗脫程序:0～2.00 min,90% A,10% B;2.00～16.00 min,90%～35% A,10%～65% B;16.00～19.00 min,35%～2% A,65%～98% B;19.00～22.00 min,2% A,98% B;22.00～22.10 min,2%～90% A,98%～10% B;22.10～25.00 min,90% A,10% B。

1.2.3 質譜條件

電噴霧離子源;掃描方式:多反應監測;離子噴霧電壓4 500 V/-4 500 V;霧化器壓力50 psi;輔助氣壓力50 psi;氣簾氣壓力30 psi;碰撞氣壓力9 psi;離子源溫度500 ℃。監測離子及質譜參數見表1。

表1 分析物的質譜信息Table 1 Mass spectrometry parameters of analytes

續表1

2 結果與分析

2.1 質譜條件優化

以針泵進樣的方式,以5 μL/min的流速向質譜儀中注入100 ng/mL那非類物質標準溶液,確定其最佳質譜條件。分別在正、負離子模式下進行一級全掃描,確定目標化合物的母離子質量數。實驗中發現,除脫哌嗪基硫代西地那非和伐地那非二聚體在負離子模式下的靈敏度遠高于正離子模式外,其余88 種那非類物質均在正模式下的響應更高,這是由于這些物質的分子結構中均含有仲胺或叔胺等基團,適合正電離模式。確定目標化合物的母離子后,對母離子進行子離子全掃描,確定其定性和定量離子。優化子離子的去簇電壓,碰撞能量等參數。目標化合物的定性和定量離子對的質譜檢測參數見表1。

2.2 色譜條件優化

2.2.1 流動相的選擇

采用正、負2 種離子模式采集,實驗對比了分別在乙腈-水、甲醇-水流動相體系中不添加與添加0.1%甲酸、氨水時,90 種那非類物質的色譜峰形和離子化程度。結果發現,采用0.1%甲酸-乙腈體系時,90 種那非類物質的離子化效果普遍較好且峰形最佳,這是由于90 種那非類物質中除脫哌嗪基硫代西地那非、伐地那非二聚體外,其余均采用正離子模式采集,加入適量的甲酸會促進胺的電離,從而提高離子化效率,后續實驗選用0.1%甲酸-乙腈體系作為流動相。

2.2.2 色譜柱的選擇

90 種那非類物質中,母離子相同二級子離子相同或部分相同的同分異構體共有8 組,分別為母離子m/z357.2的那非乙酰酸和那莫伐地那非;母離子m/z438.2的苯噻啶紅地那非和伐地那非乙酰基類似物;母離子m/z467.3的紅地那非、二甲基紅地那非和乙酰伐地那非;母離子m/z475.2的伐地那非哌嗪酮和N-去乙基-N-甲基伐地那非;母離子m/z489.2的艾地那非、豪莫西地那非、伐地那非、丙氧苯基西地那非和異丁基西地那非;母離子m/z505.2的羥基伐地那非和伐地那非N-氧化物;母離子m/z519.2的丙氧苯基羥基豪莫西地那非、丙氧苯基硫代艾地那非和丙氧苯基硫代豪莫西地那非;母離子m/z521.2的羥基硫代豪莫西地那非和羥基硫代伐地那非。

為使每種目標物都有較好的峰形和分離效果,本實驗選擇質量濃度為20 ng/mL的90 種那非類物質標準溶液,在相同的流動相和洗脫程序下,分別采用Waters Acquity BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)、XBridge BEH Shield RP18色譜柱(2.1 mm×100 mm,2.5 μ m) 、 T h e r m o A c c u c o r e a Q C18色 譜 柱(2.1 mm×100 mm,2.6 μm)、Hypersil Gold C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.9 μm)進行分離實驗。結果表明:使用Thermo Accucorea Q C18和Hypersil Gold C18色譜柱時,豪莫西地那非和伐地那非不能分離,使用XBridge BEH Shield RP18色譜柱時育亨賓出峰稍有拖尾,使用Waters Acquity BEH C18色譜柱時,色譜峰峰形良好,且8 組同分異構體(圖1)分離效果較為理想,故實驗選擇Waters Acquity BEH C18色譜柱進行分離。

圖18 組同分異構體的液相色譜-質譜圖Fig. 1 Extracted ion chromatograms of 8 sets of isomers

2.3 前處理條件優化

90 種那非類物質均難容或不溶于水,易溶于極性有機溶劑,實驗對比目標物添加量為50 μg/kg時,甲醇、乙腈和乙醇3 種溶劑的提取效果。結果表明:采用甲醇和乙腈作為提取溶劑的效果優于乙醇,二者提取結果基本一致,綜合考慮溶劑毒性、成本等問題,最終選用甲醇作為提取溶劑。

2.4 線性范圍、檢出限和定量限結果

用上述優化的條件對保健食品中90 種那非類物質進行定量分析,用甲醇稀釋標準溶液儲備液,得到系列標準工作溶液,以目標物定量離子的色譜峰峰面積為縱坐標(Y),目標物質量濃度為橫坐標(X)作線性回歸方程,以3 倍和10 倍信噪比對應的空白樣品添加質量濃度作為檢出限和定量限。如表2所示,90 種那非類物質在0.2～50 ng/mL質量濃度范圍內相關系數(r2)大于0.995,線性關系良好。檢出限為2.5～25.0 μg/kg,定量限為5.0～50.0 μg/kg,遠低于現有文獻方法與標準方法(BJS 201805)。

表2 90 種化合物的線性關系、檢出限、定量限Table 2 Linear relationships, LODs and LOQs of 90 compounds

續表2

續表2

2.5 回收率和精密度結果

在固態、液態空白基質中添加90 種那非類物質標準溶液制成陽性樣品,添加水平分別為1 倍定量限、3 倍定量限和10 倍定量限,每個添加水平進行6 次重復實驗,計算回收率和相對標準偏差(relative standard deviations,RSD),回收率結果見表3。添加量為5.0～500 μg/kg時,90 種那非在固態樣品中回收率為78.0%～109.9%,RSD為0.20%～9.96%,在液態樣品中回收率為80.5%～109.8%,RSD為1.25%～7.34%,符合檢驗方法要求。

表3 90 種化合物的回收率Table 3 Spiked recoveries of the 90 compounds%

續表3%

續表3 %

2.6 實際樣品檢測結果

應用本研究建立的方法對市場以及網上購買的10 批次固態和液態保健食品進行檢測,結果發現有1 批次保健酒樣品檢測出含有西地那非(2.83×105μg/kg)、1 批次片劑樣品檢測出含有他達拉非(3.85×106μg/kg)。

3 結 論

本研究建立超高效液相色譜-串聯質譜檢測保健食品中90 種那非類物質的分析方法,并進行方法學驗證。該方法簡單高效、選擇性好、靈敏度高,滿足大量保健品中那非類物質快速、準確定量的需要。可為基質中那非類物質的檢測提供方法參考,也可為打擊保健食品行業非法添加化學藥物行為提供有利依據。