紅螯螯蝦轉錄組中的SSR位點信息分析

李喜蓮 郭建林 李倩 施偉達 黃振遠 顧志敏

摘要：對紅螯螯蝦轉錄組測序數據進行分析，并開發引物通過PCR擴增和毛細管電泳檢測，進行了引物多態性和通用性分析。從67 369條Unigenes中共檢測到22 727個簡單重復序列（SSR）位點，并對包含SSR序列的Unigenes進行功能注釋。結果表明，紅螯螯蝦轉錄組中微衛星序列的類型較為豐富，其中二核苷酸和三核苷酸重復類型出現頻率較多，分別占總SSR出現頻率的52.67%和44.25%;四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復類型出現頻率較少，分別占總SSR出現頻率的2.62%、0.23%和0.24%。SSR重復類型共有68種，其重復次數的范圍為5～84次。篩選出SSR引物5對，對浙江本地及臺灣2個群體的60個樣品進行遺傳多樣性分析，每對引物平均產生5.6個多態性片段。本研究結果為深入開發紅螯螯蝦功能性SSR標記奠定了基礎，也為開展紅螯螯蝦分子標記輔助選育提供支持。

關鍵詞：紅螯螯蝦;轉錄組;SSR;位點信息

中圖分類號：S917.4?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）07-0207-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.07.043

Abstract： The transcriptome sequencing data of the red claw crayfish （Cherax quadricarinatus） was analyzed，and the primers were developed by PCR amplification and capillary electrophoresis，the primer polymorphism and versatility analysis were carried out. 22，727 simple repeat （SSR） sites were detected from 67，369 Unigenes，and functional annotations were performed on Unigenes containing SSR sequences. The results show that，the microsatellite sequences in the transcriptome of the red claw crayfish are abundant，and the dinucleotide and trinucleotide repeat types appear more frequently，accounting for 52.67% and 44.25% of the total SSR frequency，respectively; the tetranucleotide pentanucleotide and hexanucleotide repeat types appeared less frequently，accounting for 2.62%、 0.23%?and 0.24% of the total SSR frequency，respectively. There are 68 SSR repeat types，and the number of repetitions ranges from 5 to 84.5 pairs of SSR primers were screened，and 60 samples from Zhejiang and Taiwan were analyzed for genetic diversity，the average polymorphic fragment per every prime was 5.6. The results of this study lay the foundation for the in-depth development of functional SSR markers of red?claw crayfish，and also support the molecular marker-assisted breeding of red claw crayfish.

Key words： Cherax quadricarinatus; transcriptome; SSR; information of loci

紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）隸屬于節肢動物門甲殼綱十足目長尾亞目擬螯蝦科米殼蝦屬，于1992年由湖北省水產科學研究所引入中國，因其具有生長快、食性廣、個體大、適應性強、肉質鮮美、富含低膽固醇和高蛋白質、出肉率高、經濟價值高等優點[1]，逐漸在廣東、湖北、福建、江蘇、湖南、北京、浙江等地推廣養殖。目前，紅螯螯蝦的研究仍較少，主要集中在養殖[2]、育苗[3-5]、病害防治[6，7]、營養[8]等方面。紅螯螯蝦分子標記及遺傳多樣性研究較少，謝雁南[9]采用磁珠富集法構建了紅螯螯蝦微衛星標記的富集文庫，篩選出48個微衛星標記位點，并用于3個群體的遺傳多樣性分析。

SSR具有共顯性、多態性相對豐富、基因組覆蓋高等優點，該技術具有易于操作、周期短、等位基因多樣性高和穩定性高等特點，被廣泛應用于種質鑒定與分析、親緣關系及遺傳多樣性分析、構建遺傳連鎖圖譜等研究領域[10]。傳統SSR標記的開發方法工作量大、時間長、花費高昂且NCBI數據庫中的紅螯螯蝦SSR序列數量有限，可供開發的SSR引物數量不多。隨著RNA-Seq技術的發展，目前采用轉錄組數據開發大量SSR標記的技術被廣泛應用在不同物種的遺傳圖譜構建、種質資源分析等方面[10-13]。

本研究在紅螯螯蝦轉錄組高通量測序結果的基礎上，采用MISA軟件檢測紅螯螯蝦轉錄組數據中SSR位點并分析其分布、組成特征，同時篩選出具有多態性的引物用于浙江本地養殖群體與臺灣引進群體的遺傳多樣性檢測和驗證，以期為紅螯螯蝦的遺傳多樣性分析、良種選育和遺傳圖譜構建等研究提供序列數據基礎。

1?材料與方法

1.1?材料

紅螯螯蝦樣品取自浙江省淡水水產研究所八里店綜合試驗基地保種的浙江群體和引進的臺灣群體。取3個不同個體的肝臟、精巢和卵巢組織，提取RNA并等量混合用于文庫構建。

1.2?轉錄組數據的獲得

紅螯螯蝦轉錄組數據來源于本課題紅螯螯蝦高通量測序獲得的轉錄組深度測序。測序委托上海美吉生物醫藥科技有限公司進行，測序平臺采用Illumina HiSeq 2500。測序完成后，采用Trinity進行序列組裝，共獲得含67 369個SSR位點的Unigenes（總Unigenes長度為68 775 320 bp）。

1.3?SSR位點搜索和引物設計

采用MISA（Micro Satellite identification tool，http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）對Unigene進行SSR位點檢測，搜索參數設置為單核苷酸重復次數至少為10次，二核苷酸重復次數至少為6次，三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復次數至少為5次。2個SSR位點堿基間隔不大于100 bp。

利用Primer3軟件（http：//primer3.sourceforge.net/releases.php）為含有SSR位點的Unigene批量設計引物，引物設計的參數：序列長度18～27 bp，擴增產物長度100～350 bp，GC含量40%～60%，退火溫度設置在55～65 ℃，上下游引物的退火溫度值相差不大于5 ℃;引物長度在18～25 bp;GC含量在40%～65%;盡量避免出現發卡結構、二聚體、錯配和引物二聚體等二級結構。

1.4?SSR-PCR擴增及產物檢測

PCR反應體系為20 μL，其中包括：2×Mix Buffer 10 μL，DNA模板（15 ng/μL）1 μL，去離子水8 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL。擴增反應在Bio-rad My Cycler Thermal Cycler儀器上進行，擴增程序為：95 ℃預變性5 min。95 ℃變性30 s，45～60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s;15個循環。95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s;20個循環。72 ℃延伸7 min。PCR產物采用毛細管電泳分離鑒定。

1.5?數據分析

采用Q-Analyzer軟件對毛細管電泳儀獲得的原始數據進行分析，將各峰值的位置與其泳道中的分子質量內標進行比較得出擴增產物大小。

2?結果與分析

2.1?轉錄組中SSR的分布及結構特點

通過對紅螯螯蝦轉錄組的67 369條Unigene （序列總長約68 775.32 kb）序列進行搜索，發現這些Unigene序列中含有22 727個SSR位點，其中4 211條Unigene含有2個或2個以上EST-SSR位點。總體上，SSR發生頻率為33.74%，平均每3.03 kb出現1個SSR。紅螯螯蝦轉錄組SSR的類型較為豐富，二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸及六核苷酸重復類型均存在。其中二核苷酸和三核苷酸重復類型出現頻率較多，分別占總SSR出現頻率的52.67%和44.25%;四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復類型出現頻率較少，分別占總SSR出現頻率的2.62%、0.23%和0.24%（表1）。

2.2?轉錄組中SSR重復類型和頻率特征

從紅螯螯蝦轉錄組SSR核苷酸基序類型來看，其中11 054個SSR位點包含68種重復基元，二核苷酸至六核苷酸重復基元分別有4、10、26、11、17種;從分布頻率來看，出現最多的重復基元是AC/GT（3 324個，占30.07%）和AAT/ATT（1 371個，占10.56%）。二核苷酸重復基元以AC/GT、AG/CT和AT/AT為主，占其總數的99.67%。三核苷酸重復基元以AAT/ATT、AGC/CTG和ACC/GGT最多，分別占其總數的28.03%、23.86%和12.41%。四核苷酸重復基元以ACAT/ATGT、AAAT/ATTT和ACAG/CTGT最多，分別占其總數的28.62%、15.86%和15.86%;五核苷酸重復基元以AACCT/AGGTT和AAGAT/ATCTT出現頻率最高，分別占其總數的20%和12%;六核苷酸重復基元以ACCTGG/AGGTCC和ACGCCC/CGTGGG出現頻率最高，分別占其總數的15.38%和11.54%（表2）。

2.3?轉錄組中SSR重復次數

紅螯螯蝦轉錄組SSR重復單元的重復次數分布在5～84次，其中5～10次重復的SSR位點有1 911個，占總數的17.29%;11次重復以上的有80個，占7.24%。所有紅螯螯蝦轉錄組SSR重復單元中，以5次重復次數的SSR最多，占7.32%;6次重復的次之，占3.22%。6種重復基序的重復次數隨著基序堿基數的增加而減少（表3）。

2.4?SSR引物篩選及驗證

PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示，有5對SSR引物（CQ-4、CQ-9、CQ-13、CQ-19、CQ-20）對2個不同來源的紅螯螯蝦群體肌肉組織中擴增出了具有多態性的特異性條帶（表4），說明這些SSR位點可以作為紅螯螯蝦特有的分子標記，基于轉錄組數據大規模開發SSR分子標記具有良好的前景。

2.5?SSR多態性分析

為含SSR位點的100條Unigene序列設計引物，共設計了100對SSR位點特異性引物，并驗證引物的有效性，隨機挑選并合成了20對SSR引物，以浙江本地養殖群體和臺灣引進群體的基因組DNA為模板，對合成的20對引物進行PCR擴增、篩選。結果表明，5對引物擴增具有多態性，占有效引物的25%。5對引物共得到28個條帶，每對引物平均產生5.6個多態性片段。引物CQ-4的毛細管電泳結果見圖1。

3?小結與討論

3.1?SSR位點出現頻率與其他物種的比較

根據紅螯螯蝦轉錄組測序獲得的Unigene進行SSR熱分布及其序列特征分析，從67 369條Unigene上發現22 727個SSR位點，SSR發生頻率為33.74%，平均每3.03 kb出現1個SSR，和蜜蜂幼蟲相近[14]。但在重復類型和頻率特征方面，紅螯螯蝦和其他物種有較大的差異。EST-SSR 分析發現，中華蜜蜂幼蟲中 90%以上為單堿基和二堿基SSR 序列[14，15]，窄足真蚋 EST-SSR分析結果發現單核苷酸重復類型出現的比例最高，占總SSR的87.05%[16]，武昌魚（Megalobrama amblycephalaYih）和黃魚（Larimichthyspolyactis Bleeker）轉錄組分析表明二堿基重復占絕大多數，其次是占較小比例的三堿基[17]，羅氏沼蝦轉錄組中各種SSR出現頻率差異較大，各類型出現的頻率不同，主要為單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸重復[18]。2種扇貝轉錄組中單核苷酸至六核苷酸重復SSR均有發現，從6種重復基序SSR的數量來看，2種扇貝轉錄組SSR的優勢基序為單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸，四至六核苷酸重復SSR的數量較少[19]。本研究發現，在紅螯螯蝦所有的SSR重復基序中，占主導地位的重復基序主要是二核苷酸和三核苷酸，分別占總SSR的52.67%和44.25%，在二核苷酸重復基序中，以AC/GT和AG/CT重復類型出現的次數最多;在三核苷酸重復基序中，以AAT/ATT重復類型為主，這與王斌等的研究結果相同[20]。物種SSR重復類型多數以二、三核苷酸為主，可能是由于三核苷酸突變不易引起物種突變，面對重大突變壓力時，物種更傾向選擇三核苷酸，且起源越早、壓力選擇累積越多。在動植物的轉錄組或基因組中，GC/CG是二堿基重復的SSR中的稀有重復基元。本研究發現GC/CG核心基元數量僅為1個，與前人研究結果類似[21]。

在非模式生物的微衛星標記開發上，現階段轉錄組數據的利用率被大大提升，被廣泛應用于各物種的研究當中。本研究從100對四堿基重復的微衛星引物中篩選獲得了16對具有多態性的微衛星標記，引物多態率相對低于其他魚類的研究結果。造成多態性較低的原因，一方面是由于選取的四堿基重復的微衛星相對于二堿基和三堿基重復的微衛星比較保守，且變異率低;另一方面是由于基于轉錄所獲得的EST-SSR擴增產物可能跨越內含子或者PCR引物位于內含子和外顯子的結合處，從而造成擴增失敗，導致多態率較低。此外，篩選多態性引物所用樣本的種類、數量、遺傳差異程度以及不同物種的DNA序列的保守性對于微衛星位點多態性的篩選亦有不同程度的影響[22]。

3.2?轉錄組篩選紅螯螯蝦SSR引物可行且有意義

對于沒有基因組信息的非模式物種，主要基于表達序列標簽（EST）和轉錄組數據分析SSR標記，由于這些標記主要位于編碼區域（這些區域為功能基因區），因此研究的SSR結果更加可靠。而與基于EST數據的SSR分析相比，轉錄組SSR分析可以獲得更多的信息，已經被廣泛應用[23]。

本研究發現，紅螯螯蝦轉錄組SSR引物出現頻率高且種類豐富，可為紅螯螯蝦的功能基因挖掘、分子標記輔助育種、遺傳多樣性分析、比較基因組研究及遺傳圖譜繪制等研究工作提供候選標記，也為今后分子標記輔助育種及群體遺傳學研究提供了第一手研究資料。對于加速紅螯螯蝦功能基因資源的開發利用、豐富其分子標記類型、遺傳資源評價、繪制遺傳圖譜、實現特定性狀的輔助選擇和進行比較基因組學研究都具有重要的意義，并且結合這些Unigene基因信息和SSR位點能對紅螯螯蝦的系統進化研究提供依據。

本研究基于紅螯螯蝦的轉錄組數據預測潛在的SSR分子標記，隨機選取的5對特異性SSR引物可在浙江、臺灣2個不同來源的群體樣品中擴增出具有多態性的片段，這些新開發的SSR分子標記有助于紅螯螯蝦的基因圖譜構建、基因多樣性分析、基因定位等研究的深入開展，說明基于轉錄組測序數據大規模開發SSR分子標記具有良好的應用前景。

參考文獻：

[1] 段?虎. 紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）血細胞培養及細胞免疫學研究[D]. 北京：中國科學院研究生院（海洋研究所），2014.

[2] 陳奕彬，李色東. 紅螯螯蝦繁育關鍵技術[J]. 科學養魚，2018（2）：6-7.

[3] 王在文. 紅螯螯蝦土池人工育苗與養殖技術[J]. 科學養魚，2017（2）：33-34.

[4] 戴遠棠. 澳洲淡水龍蝦苗種繁育及池塘養殖技術研究[J]. 科學養魚，2017（1）：36-37.

[5] 李衛芳. 紅螯螯蝦規模化育苗技術報告[J]. 水產養殖，2013（2）：20-22.

[6] 王甜甜. 紅螯螯蝦虹彩病毒（CQIV）與白斑綜合癥病毒（WSSV）感染的組織細胞特異性以及感染途徑的研究[D]. 廈門：國家海洋局第三海洋研究所，2016.

[7] 黃東平，陳自立，齊?雄. 紅螯螯蝦親本“偷死”的防治[J]. 科學養魚，2014（11）：59-60.

[8] 蔣琦辰，馮曉慶，張呈祥，等. 飼料蛋白質水平對紅螯螯蝦生長、消化酶和抗氧化系統的影響[J]. 淡水漁業，2013，43（2）：60-65.

[9] 謝雁南. 紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）微衛星標記篩選及群體遺傳學分析[D]. 上海：華東師范大學，2011.

[10] 郭棟梁，王?靜，韓冬梅，等. 龍眼頂芽轉錄組簡單重復序列（SSR）標記信息分析及分子標記開發[J]. 植物生理學報，2018，54（5）：863-871.

[11] 林?琿，李永平，薛珠政，等. 花椰菜轉錄組SSR位點分析及其分子標記開發[J]. 西北農林科技大學學報（自然科學版），2019，47（3）：1-8.

[12] 陳曉明，李魁鵬，陳博雯，等. 馬尾松轉錄組SSR序列特征分析及其分子標記開發[J]. 分子植物育種，2018，16（19）：6407-6414.

[13] 杜明鳳，丁貴杰. 基于馬尾松干旱轉錄組的抗旱功能SSR位點分析[J]. 林業科學研究，2018，31（5）：9-19.

[14] 徐細建，郭?睿，駱?群，等. 中華蜜蜂幼蟲腸道參考轉錄組的de novo組裝及SSR分子標記鑒定[J]. 中國農業科學，2017，50（6）：1157-1167.

[15] 熊翠玲，張?璐，付中民，等. 基于RNA-seq數據大規模開發中華蜜蜂幼蟲的SSR分子標記[J]. 環境昆蟲學報，2017，39（1）：68-74.

[16] 郭?歡，王?剛，張樹田，等. 基于RNA-seq數據的窄足真蚋SSR分子標記開發[J]. 昆蟲學報，2018，61（7）：815-824.

[17] 于愛清，施永海，徐嘉波，等. 長江刀鱭選育群體轉錄組EST-SSR的分布特征分析[J]. 漁業科學進展，2019，40（5）：1-9.

[18] 王傳聰，唐修陽，項?杰，等. 羅氏沼蝦轉錄組SSR標記信息分析[J]. 江蘇農業科學，2018，46（22）：56-59.

[19] 譚?杰，姚高友，劉志剛，等. 扇貝“渤海紅”與墨西哥灣扇貝轉錄組SSR信息分析及Unigene功能注釋[J]. 基因組學與應用生物學，2017，37（12）：5242-5250.

[20] 王?斌，孫?靜，劉凌云，等. 蛭類轉錄組中EST-SSR分析及抗凝血相關分子標記的挖掘[J]. 中草藥，2017，48（1）：172-178.

[21] 張琳琳，魏朝明，廉振民，等. 赤擬谷盜全基因組和EST中微衛星的豐度[J]. 昆蟲知識，2008，45（1）：38-42.

[22] 陸云峰，楊安娜，張俊紅，等. 紫楠轉錄組EST-SSR標記開發及通用性分析[J]. 農業生物技術學報，2018，26（6）：1014-1024.

[23] 張?婕，李西文. 川貝母轉錄組中SSR位點信息分析[J]. 中國實驗方劑學雜志，2018，24（18）：30-35.