高通量測序研究中藥復方對流感病毒感染小鼠腸道菌群的影響

鐘婧，張俊杰，李珂，葉賀賀，張淑靜，葛東宇，吳瑩

1.北京中醫藥大學生命科學學院，北京 100029；2.北京中醫藥大學中醫學院，北京 100029

流行性感冒是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染性疾病，若治療不及時，將引發嚴重的并發癥甚至死亡。腸道獨特的微生物群落可影響宿主抵御流感病毒的感染[1-3]。研究表明，小鼠感染流感病毒后，腸道菌群呈現失調狀態[4-5]。Groves 等[6]發現，流感小鼠擬桿菌門增加、厚壁菌門減少；而Yildiz 等[7]研究表明，流感小鼠擬桿菌門數量減少、厚壁菌門增加。有報道，四君子湯對脾虛小鼠腸道菌群失調有明顯改善作用[8-12]。我們前期研究發現，四君子湯、麻杏石甘湯、麻杏石甘湯合四君子湯均可改變正常小鼠腸道菌群的構成及比例[13]。本研究通過高通量測序，力圖全面展示小鼠感染流感病毒后體內菌群變化，以觀察藥物對感染小鼠腸道菌群的影響。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF 級雄性Balb/C 小鼠25 只，體質量17～19 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號SCXK（京）2016-0011。飼養于北京中醫藥大學實驗動物中心SPF 級動物房，溫度（22±2）℃，相對濕度60%±10%，12 h/12 h 明暗周期，自由攝食飲水。

1.2 流感病毒株

甲型流感病毒鼠肺適應株PR8（A/PR/8/34），中國預防醫學科學院病毒學研究所提供，本室-80 ℃保存。采用Reed Muench 法測定并計算其對小鼠的半數致死量（LD50）為10-5。

1.3 藥物及制備

麻杏石甘湯（麻黃6 g，苦杏仁9 g，生石膏24 g，甘草6 g），麻黃和生石膏單獨浸泡于蒸餾水中40 min，生石膏先煎30 min，加苦杏仁、甘草熬至水沸，小火煎煮15 min，加入麻黃，再煎煮5 min，倒出藥液加水第2 次煎煮（煮沸后小火煎煮10 min），最后將2次藥液混合濃縮至30 mL，制成含原藥材1.5 g/mL 的藥液。四君子湯（茯苓10 g，黨參10 g，炙甘草10 g，白術10 g），飲片浸泡于蒸餾水中40 min，第1 次煎大火煮沸后，小火煎煮30 min，第2 次煎大火煮沸后，小火煎煮20 min，合并2 次煎藥，濃縮，制成含原藥材1.5 g/mL 藥液。麻杏石甘湯合四君子湯:將制備的2 組湯藥各取10.5 mL 混合并濃縮至10.5 mL。上述飲片均購自北京中醫藥大學國醫堂，藥物經煎煮、過濾、濃縮后，置于4 ℃冰箱保存備用。

1.4 主要試劑與儀器

土壤soil DNA 提取試劑盒（Omega Bio-Tek），PCR 擴增試劑盒（Trans Gen），2%瓊脂糖凝膠、AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒（AXY GEN）。移液槍（Eppendorf），熒光實時定量PCR 儀（ABI），高速臺式冷凍離心機（Eppendorf），小型離心機（Eppendorf），電泳儀（北京市六一儀器廠），Miseq測序儀（Illumina）。

2 實驗方法

2.1 造模

將小鼠適應性飼養2～3 d。乙醚輕微麻醉小鼠，病毒組和各給藥組予0.1 血凝素蛋白亞致死量流感病毒稀釋液25 μL 滴鼻感染，建立小鼠亞致死量流感病毒感染模型；正常組給予等量無菌生理鹽水滴鼻。

2.2 分組

小鼠按隨機數字表法分為正常組、病毒組、麻杏石甘湯組（麻杏組）、四君子湯組（四君組）、麻杏石甘湯合四君子湯組（麻四組），每組5 只。正常組和病毒組給予無菌雙蒸水灌胃，其余3 組分別給予相應藥液灌胃，0.15 mL/次，2 次/d，各組于第4、7 日末次給藥8 h 后，無菌條件取小鼠糞便，Illumina Miseq高通量測序檢測各組藥物對病毒感染小鼠腸道菌群的影響。

2.3 給藥

感染1 h 后，正常組和病毒組給予無菌雙蒸水灌胃，0.15 mL/次，2 次/d；其余3 組分別予相應藥液灌胃，0.15 mL/次，2 次/d。均連續灌胃7 d。

2.4 樣本采集

第4、7 日小鼠灌胃后8 h 取材。超凈臺紫外線照射并通風，將無菌濾紙置于臺上，一只手固定小鼠頸部，另一只手在小鼠肛門處撫摸排便，使排出糞便掉落在無菌濾紙上；用鑷子將糞便（糞便粒數≥3）夾到凍存管里，擰緊蓋子，對樣本編號，放入液氮保存。

2.5 高通量測序

DNA 提取試劑盒提取糞便DNA，對細菌16 s 核糖體RNA 基因V3～V4 區擴增，各樣本均加8 bp 標簽序列3 次擴增重復。擴增后凝膠回收試劑盒回收PCR 產物，隨后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將電泳結果使用熒光定量，并構建Miseq 文庫、Miseq 測序。

3 統計學方法

采用SPSS20.0 統計軟件進行分析。組間比較用方差分析。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 流感小鼠模型建立評價

正常組小鼠毛發順滑光亮，行動敏捷，反應靈敏，精神狀態良好；病毒組小鼠毛發不順滑無光澤，蜷縮不動，可聽到小水泡樣呼吸聲，喘促明顯，反應遲鈍，精神狀態差；四君組小鼠狀態與病毒組相似；麻杏組和麻四組小鼠狀態較病毒組好轉，毛發有序，反應較靈敏，精神狀態較好。

4.2 樣本序列信息統計

經Illumina 測序，5 組50 個樣本共獲得2 893 730 條優化序列，平均每個樣本57 875 條優化序列，優化序列平均長度為439。正常組共獲得580 530 條優化序列，病毒組共獲得601 617 條優化序列，四君組共獲得564 877 條優化序列，麻杏組共獲得566 150 條優化序列，麻四組共獲得580 556 條優化序列。小鼠感染流感后，其樣本優化序列總和在2 個時間段內較正常組均升高；四君組與麻杏組樣本優化序列總和在2 個時間段內較病毒組均降低；麻四組樣本優化序列總和在第4 日較病毒組降低，而在第7 日升高。各組樣本序列詳見表1。

4.3 藥物對流感小鼠菌群豐富度和多樣性的影響

4.3.1 Alpha 多樣性分析

通過單樣本Alpha 多樣性分析反映微生物群落的豐富度和多樣性，包括一系列統計學分析指數估計環境群落的物種豐度和多樣性。反映群落豐富度（community richness）的指數有Ace 指數、Chao 指數、Sobs 指數；反映群落多樣性（community diversity）的指數有Shannon 指數、Simpson 指數；反映群落覆蓋度（community coverage）的指數有Coverage 指數。上述指數中，Shannon 指數值越大，說明群落多樣性越高；Simpson 指數值越大，說明群落多樣性越低；Coverage 指數是各樣本文庫的覆蓋率，其數值越高，則樣本中序列被測出的概率越高，而未被測出的概率越低，該指數反映本次測序結果是否代表樣本中微生物的真實情況。各樣本多樣性指數見表2。對比感染流感病毒小鼠和正常小鼠發現，隨著時間的變化，尤其是第7 日，各樣本數呈現不同程度的變動。說明小鼠感染流感病毒后，腸道菌群比例、菌群豐富度和多樣性發生變化。

表1 各組樣本序列總和不同時點比較

表2 各組小鼠腸道菌群樣本多樣性指數比較

續表2

4.3.2 稀釋曲線分析

稀釋曲線（rarefaction curve）可用來比較測序數據量不同樣本中物種的豐富度、均一性或多樣性，也可用來說明樣本的測序數據量是否合理。如圖1 所示，Shannon-Wiener 曲線趨向平坦時，說明測序數據量足夠大，可反映樣本中絕大多數微生物多樣性信息，Shannon 指數值越大，說明群落多樣性越高。感染病毒后，小鼠菌群Shannon 指數在第4 日較正常組升高，第7 日較正常組降低，說明小鼠感染流感病毒后，第4 日菌群群落多樣性增加，而第7 日多樣性減少。四君組、麻杏組與麻四組小鼠感染后第4、7 日，各組Shannon 指數較病毒組均降低，其菌群多樣性均減少。表明流感病毒感染會影響正常小鼠菌群多樣性，各藥物使用對病毒感染小鼠腸道菌群的多樣性產生影響。

4.4 藥物對流感小鼠腸道菌群相似度的影響

通過物種韋恩圖（Venn dia gram）分析，可比較各組間獨有和共有的OTU 數目，進而比較多個樣本群落間組成的相似度與重疊關系。如圖2 所示，病毒組和正常組感染第4、7 日共有的OTUs 數目分別為626、627，正常組獨有的OTUs 數目分別為32、24，病毒組獨有的OTUs 數目分別為36、30；病毒組和四君組感染第4、7 日共有OTUs 數目分別為631、615，病毒組獨有的OTUs 數目分別為31、42，四君組獨有的OTUs 數目分別為31、30；病毒組和麻杏組感染第4、7 日共有的OTUs 數目分別為624、622，病毒組獨有的OTUs 數目分別為38、35，麻杏組獨有的OTUs數目分別為28、31；病毒組和麻四組感染第4、7 日共有的OTUs 數目分別為627、623，病毒組感染第4、7 日，獨有的OTUs 數目分別為35、34，麻四組感染第4、7 日獨有的OTUs 數目分別為355、34。結果顯示，流感病毒感染小鼠后，隨著給藥時間的延長，各給藥組和病毒組間共有的OOTUs 數目均減少，其中，病毒組和四君組間共有的OOTUs 數目減少最多，其菌群相似性變化也最明顯。

圖6 病毒組和正常組小鼠腸道菌群顯著性差異圖

圖7 病毒組和四君組小鼠腸道菌群顯著性差異圖

圖8 病毒組和麻杏組小鼠腸道菌群顯著性差異圖

圖9 病毒組和麻四組小鼠腸道菌群顯著性差異圖

表3 病毒組和正常組不同時間段顯著性差異菌屬變化情況

表4 各藥物組與病毒組不同時間段顯著性差異菌屬變化情況

圖6 所示，病毒感染第4 日，正常組和病毒組在屬分類學水平上有4 種細菌表現出顯著差異，病毒組Tyzzerella 顯著增加，Eubacterium_Ventriosum_ group、Faecalitalea、norank_f_Christensenellaceae 顯著減少。感染第7 日，有16 種菌屬在正常組和病毒組間表現出顯著差異，病毒組Alloprevotella 擬普雷沃菌屬、Rumiclostridium 、 norank_f_ Ruminococcaceae 、Anaerotruncus、Parabacteroides、Oscillibacter 顫螺旋菌屬、Peptococcus 消化球菌屬、Tyzzerella、unclassified_f_Prevotellaceae、Bilophila 嗜膽菌屬顯著增加，Ruminococcaceae_UC G_014、Lactobacillus 乳桿菌屬、Anaerofustis、Eubacterium_Ventriosum_ group、norank_o_Mollicutes_ RF9、Candidatus_Arthromitus 分段絲狀細菌顯著減少。

圖7 所示，病毒感染第4 日，病毒組和四君組在屬分類學水平上有12 種細菌表現出顯著差異，四君組Ruminococcaceae_UC G_014、Ruminococcaceae_UC G_002、norank_f_Coriobacteriaceae、norank_f_Christensenellaceae、Parasutterella 帕拉薩特菌屬、norank_f_Rhodospirillaceae、Eubacterium_Ventriosum_group 顯 著 增 加， norank_f_Lachnospiraceae 、Peptococcus 消化球菌屬、Tyzzerella、Candidatus_Arthromitus 分 段 絲 狀 細 菌 、 norank_f_Ruminococcaceae 顯著減少。感染第7 日，有16 種菌屬在病毒組和四君組間表現出顯著差異，四君組Ruminococcaceae_UC G_014 、 Akkermansia 、Parasutterella 帕 拉 薩 特 菌 屬 、 norank_f_Coriobacteriaceae、 Ruminococcaceae_UC G_005、norank_f_Christensenellaceae 、 Enterorhabdus 、Desulfovibrio 脫硫弧菌屬、Eubacterium_Ventriosum_group 顯 著 增 加， Rumiclostridium 、 norank_f_Clostridiales_vadinBB60_group、norank_f_Ruminococcaceae、Anaeroplasma、Oscillibacter 顫螺旋菌屬、Peptococcus 消化球菌屬、Tyzzerella 顯著減少。

圖8 所示，病毒感染第4 日，病毒組和麻杏組在屬分類學水平上有12 種細菌表現出顯著差異，麻杏組 Eubacterium_Ventriosum_ group 顯著增加，norank_f_Lachnospiraceae 、 Rumiclostridium 、Marvinbryantia 、 Desulfovibrio 脫硫弧菌屬、Anaerotruncus、Candidatus_Arthromitus 分段絲狀細菌、 Oscillibacter 顫螺旋菌屬、 norank_f_Ruminococcaceae 、 Blautia 、 Ruminococcaceae_UC G_009、Tyzzerella 顯著減少。感染第7 日，有9 種菌屬在病毒組和麻杏組間表現出顯著差異，麻杏組Ruminococcaceae_UC G_014、Subdoli granulum、Rhodococcus、Ruminococcaceae_NK4A214_ group、Anaerofustis、Parasutterella 帕拉薩特菌屬顯著增加，norank_f_Lachnospiraceae、unclassified_f_Lachnospiraceae、Blautia 顯著減少。圖9 所示，病毒感染第4 日，病毒組和麻四組在屬分類學水平上有10 種細菌表現出顯著差異，麻四組Bacteroides 擬桿菌屬、unclassified_o_Clostridiales、Eubacterium_Ventriosum_ group 顯著增加， Eisenber giella 、 Ruminococcaceae_UC G_009 、 Blautia 、 Eubacterium_xylanophilum_ group、Peptococcus 消化球菌屬、Tyzzerella、Butyricicoccus 顯著減少。感染第7 日，有19 種菌屬在病毒組和麻四組間表現出顯著差異，麻四組 Ruminococcaceae_UC G_014、Anaerofustis、Parasutterella 帕拉薩特菌屬顯著增加， norank_f_Ruminococcaceae 、 Anaerovorax 、Lachnoclostridium、Family_XIII_UC G_001、Blautia、 Oscillibacter 顫螺旋菌屬、 Anaerotruncus 、 unclassified_o_Clostridiales 、 Ruminiclostridium_9 、Tyzzerella 、 Butyricicoccus 、 Coprococcus_1 、 Lachnospiraceae_FCS020_ group、Bilophila 嗜膽菌屬、Defluviitaleaceae_UC G_001、Peptococcus 消化球菌屬顯著減少。

5 討論

高通量測序結果表明，小鼠感染流感病毒后，腸道菌群比例失調，菌群豐度及多樣性會發生變化；藥物干預后，各藥物組小鼠腸道菌群微生物多樣性異于病毒組小鼠。

短鏈脂肪酸（SCFA）在炎癥反應及免疫系統的調節中發揮了重要作用[14-15]。研究顯示，腸道菌群中的特定菌屬能增強抗炎Treg 或者促炎Th17 細胞的生成，從而影響炎癥反應，正是腸道菌群的代謝產物SCFA 介導了腸道菌群與免疫系統間的交流，影響促炎與抗炎機制之間的平衡[16-17]。

在優勢菌屬上，感染流感病毒后，2 個時間段病毒組小鼠Ruminococcaceae_UC G_014 菌屬均不再是占比最高的四大菌屬之一，其占比較正常組下降約4%；感染第 4 日，病毒組中 Lachnospiraceae_NK4A136_ group 占比較正常組下降1.35%。僅從腸道優勢菌屬變化出發，可初步說明流感病毒感染，造成病原菌升高、SCFAs 產生相關菌屬降低，引起腸道菌群的失調。

在屬水平顯著差異上，病毒感染第7 日，病毒組誘導免疫應答所必需的共生菌 Candidatus_Arthromitus 分段絲狀細菌、益生菌Lactobacillus 乳桿菌屬顯著減少，與心血管疾病風險相關的Tyzzerella在2 個時間段內均顯著增加。與SCFAs 產生相關的細菌，在病毒感染第4 日，Eubacterium_Ventriosum_group 顯著降低；病毒感染第7 日，Anaerofustis、Eubacterium_Ventriosum_ group、Ruminococcaceae_UC G_014 顯著減少，而同為丁酸產生相關菌屬Anaerotruncus、Alloprevotella擬普雷沃菌屬顯著增加。

在優勢菌屬上，四君組 Ruminococcaceae_UC G_014 再成為2 個時間段占比最高的四大菌屬之一，其占比較病毒組均升高，而四君組中丁酸鹽產生菌Alloprevotella 擬普雷沃菌屬占比在病毒感染第7 日較病毒組降低2.72%，由于有機體會競爭相同的底物或者形成抑制物質，因此，Alloprevotella 擬普雷沃菌屬的變化與Ruminococcaceae_UC G_014 此類產丁酸的細菌呈相反趨勢是合理的。麻杏組Ruminococcaceae_UC G_014 的變化情況與四君組一致。麻杏組Alloprevotella 擬普雷沃菌屬在感染第4 日較病毒組增加，卻在感染第7 日略下降。麻四組Ruminococcaceae_UC G_014 占比2 個時間段較病毒組分別增加2.62%、11.03%。

四君組在感染第4 日，Candidatus_Arthromitus分段絲狀細菌、病原菌Tyzzerella 顯著減少；在感染第7 日，Akkermansia、Desulfovibrio 脫硫弧菌屬、Enterorhabdus 顯著性增加，病原菌Oscillibacter 顫螺旋菌屬及Tyzzerella 顯著減少；麻杏組在感染第4 日，Candidatus_Arthromitus 分段絲狀細菌、病原菌Desulfovibrio 脫硫弧菌屬、Oscillibacter 顫螺旋菌屬、Tyzzerella 顯著減少；麻四組在感染第4 日，病原菌Tyzzerella 顯著減少；感染第7 日，病原菌Oscillibacter顫螺旋菌屬、Tyzzerella 在麻四組中顯著減少，說明四君子湯與麻杏石甘湯合用，會使病毒感染小鼠腸道的病原菌顯著降低。

通過對比以上實驗結果發現，各藥物均對病毒感染造成的腸道菌群失調產生影響，丁酸產生菌科的Ruminococcaceae_UC G_014 在病毒組小鼠中顯著降低，各藥物的應用使該菌屬重新成為占比最高的四大菌屬之一；而麻杏石甘湯合四君子湯對腸道菌群的影響不僅是2 個單方作用的疊加:在各組占比最高的四大菌屬中，與SCFAs 產生相關的優勢菌屬不盡相同，如病毒感染第4 日，除Ruminococcaceae_UC G_014外，Unclassified_f_Lachnospiracea 是四君組中四大菌屬之一，Alloprevotella 擬普雷沃菌屬是麻杏組四大菌屬之一，而麻四組中的四大優勢菌屬之一則是Prevotellaceae_UC G_001。

流感病毒感染會使小鼠病原菌 Alistipes、Tyzzerella 增加，益生菌分段絲狀細菌、乳桿菌減少，與SCFAs 產生相關的菌屬減少，引起嚴重的失調。四君子湯、麻杏石甘湯、麻杏石甘湯合四君子湯的使用會不同程度地改善流感引起的這種失調狀態:對流感小鼠而言，四君子湯可降低病原菌 Alistipes、Tyzzerella 等的含量、使益生菌Akkermansia 增加；麻杏石甘湯可使病原菌脫硫弧菌屬、顫螺旋菌屬和Tyzzerella 數量減少的同時引起病原菌Alistipes 的增加，對流感小鼠的腸道菌群造成顯著影響；麻杏石甘湯合四君子湯使病原菌Tyzzerella 和顫螺旋菌屬顯著下降。此外，四君子湯與麻杏石甘湯單獨使用第4 日均引起病毒小鼠腸道內益生菌分段絲狀細菌數量下降，而四君子湯與麻杏石甘湯的聯合使用抑制了分段絲狀細菌減少與Alistipes 增加的趨勢。不管在正常小鼠還是流感小鼠模型上，麻杏石甘湯均增加Alistipes的占比，說明某些清熱類中藥藥性苦寒，可能對菌群有一定的“毒性”作用，在抑制某些益生菌的同時也會引起病原菌的增加，而四君子湯可中和這種毒副作用。另外，各組藥物應用與SCFAs 產生相關菌屬發生復雜變化。

綜上，本研究建立流感小鼠模型，通過Illumina Miseq 高通量測序技術對樣本各項指數測序，確立流感小鼠、服用各藥物小鼠的腸道菌群多樣性和結構發生不同程度變化。使用LEfSe 軟件對各組小鼠腸道特定菌群分類，最終通過對比分析，探討四君子湯、麻杏石甘湯、麻杏石甘湯與四君子湯合用對病毒感染小鼠腸道菌群種類數量的變化，明確不同湯藥對流感小鼠的作用。

通過實驗我們發現，各藥物的應用使小鼠腸道菌群發生結構及比例的變化:四君子湯可通過增加益生菌的含量而對腸道菌群產生較為溫和的影響，麻杏石甘湯對腸道菌群的影響更為顯著；麻杏石甘湯與四君子湯合用可增加益生菌、減緩病原菌增加的趨勢，而且合方的應用產生與單方不同的變化。此外，四君子湯、麻杏石甘湯合四君子湯的應用可顯著增加與SCFAs 產生相關的菌屬。