昆侖雪菊水提物通過AMPK-mTOR通路調(diào)節(jié)INS-1胰島β細(xì)胞自噬的研究

（.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 8300；.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 8300）

新疆昆侖雪菊為新疆特有植物，學(xué)名為兩色金雞菊（coreopsis tinctoria），屬菊科金雞菊屬一年生草本植物?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明昆侖雪菊具有調(diào)血脂、降血壓、降血糖、抗衰老、抗凝血以及調(diào)節(jié)腸道菌群等藥理作用[1-6]。本課題組前期研究結(jié)果證實(shí)昆侖雪菊水提物可顯著抑制棕櫚酸所致INS-1胰島β細(xì)胞的損傷，但其作用機(jī)理尚未明確[7]。因此本研究基于棕櫚酸誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞損傷模型，從調(diào)節(jié)自噬角度分析新疆昆侖雪菊水提物對(duì)胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制，為其在保護(hù)胰島細(xì)胞、防治糖尿病方面的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大鼠胰島素瘤INS-1細(xì)胞株（購(gòu)自吉?jiǎng)P生物公司）；昆侖雪菊水提物凍干粉由本課題組自主研制。

1.1.1 主要儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Smart Cell HF-90，上海力康儀器有限公司），生物安全柜（HF 1200 LC，上海力康儀器有限公司），熒光倒置顯微鏡（Eclipse TS 100-F，日本尼康公司），全光柵酶標(biāo)儀（美國(guó)BIORAD公司），電子分析天平（AB304-S，德國(guó)梅特勒公司），流式細(xì)胞儀（EPICS ALTRA，美國(guó)Beckman Coulter公司），化學(xué)發(fā)光成像儀系統(tǒng)（Chemiscope 3000，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司），蛋白轉(zhuǎn)膜儀（Mini-PROTEAN Tetra system，美國(guó)伯樂公司），電泳儀（DYCZ-24DN，北京六一儀器廠）。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清（FBS，批號(hào)16000044，美國(guó)Life technologies公司），RPMI 1640培養(yǎng)基（批號(hào)ZLI-9062，美國(guó)Gibco公司），0.25%胰酶（Trypsin-EDTA，批號(hào)25200-056，美國(guó)Gibco公司），青霉素-鏈霉素雙抗（10 000 U）（貨號(hào)SC30010，美國(guó)Gibco公司），CCK8試劑盒（貨號(hào)FC101-03，北京全式金生物公司），化合物 C（貨號(hào)P5499-5MG，美國(guó)Sigma公司），β-巰基乙醇（貨號(hào)M3148-25ML，美國(guó)Sigma公司），棕櫚酸（貨號(hào)P0500-25G，美國(guó)Sigma公司），DAPI染色液（北京索萊寶科技有限公司），AnnexinV-FITC試劑盒（上海貝博生物公司）。一抗兔抗鼠LC3A/B多克隆抗體（貨號(hào)12741T），兔抗鼠AMPKα多克隆抗體（貨號(hào)5832T），兔抗鼠Phospho-AMPKα（Thr172）多克隆抗體（貨號(hào)2535T），兔抗鼠mTOR多克隆抗體（貨號(hào)2983T），兔抗鼠Phospho-mTOR（Ser2448）多克隆抗體（貨號(hào)5536T），兔抗鼠Hamartin/TSC1多克隆抗體（4906S）均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司。超敏發(fā)光液（批號(hào)34080，美國(guó)Thermo公司），BCA 蛋白定量試劑盒（貨號(hào)PA115-02，北京天根公司），HRP標(biāo)記羊抗兔IgG二抗（批號(hào)31460，美國(guó)Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 試劑配制 昆侖雪菊水取物溶液配制：用DMSO溶液將昆侖雪菊水提物配置成終濃度為50 mg·mL-1的溶液，后續(xù)不同濃度的昆侖雪菊水提物溶液用完全培養(yǎng)基稀釋獲得。

棕櫚酸（palmitic acid，PA）溶液配制：首先用0.1 mol·L-1的NaOH將棕櫚酸固體在70 ℃水浴中溶解為100 mmol·L-1溶液，同時(shí)用蒸餾水配制5%的BSA的水溶液，70 ℃水浴，再將100 mmol·L-1的棕櫚酸溶液與5%的BSA溶液（1∶9）混合，70 ℃水浴震蕩10 s，70 ℃水浴10 min，取出冷卻，0.22 μm濾膜過濾備用。

化合物C：用DMSO溶液將固體化合物C配置成終濃度為10 mmol·L-1的溶液，后續(xù)不同濃度的化合物C溶液用完全培養(yǎng)基稀釋獲得。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) INS-1細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的RPMI-164培養(yǎng)基（含11.1 mmol·L-1葡萄糖、10 mmol·L-1HEPES、50 μmol·L-1β-巰基乙醇，1 mmol·L-1丙酮酸鈉，100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素）培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育。

1.2.3 細(xì)胞分組與藥物干預(yù) 將INS-1細(xì)胞按70%匯合率接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)24 h貼壁后，將細(xì)胞分為：正常對(duì)照組（加入完全培養(yǎng)基），棕櫚酸組（加入棕櫚酸190 μmol·L-1進(jìn)行干預(yù)），0.1 μg·mL-1昆侖雪菊水提物+棕櫚酸組（加入昆侖雪菊水提物0.1 μg·mL-1預(yù)處理2 h+棕櫚酸190 μmol·L-1進(jìn)行干預(yù)），5 μg·mL-1昆侖雪菊水提物+棕櫚酸組（加入昆侖雪菊水提物5 μg·mL-1預(yù)處理2 h+棕櫚酸190 μmol·L-1進(jìn)行干預(yù)），10 μg·mL-1昆侖雪菊水提物+棕櫚酸組（加入昆侖雪菊水提物10 μg·mL-1預(yù)處理2 h+棕櫚酸190 μmol·L-1進(jìn)行干預(yù)），化合物C+10 μg·mL-1昆侖雪菊水提物+棕櫚酸組（加入化合物C 20 μmol·L-1+昆侖雪菊水提物10 μg·mL-1預(yù)處理2 h+棕櫚酸190 μmol·L-1進(jìn)行干預(yù)）。

1.2.4 Western Blotting檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3-I/LC3-Ⅱ 將INS-1細(xì)胞按70%匯合率接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)24 h貼壁后，按“1.2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組及藥物干預(yù)，每組3個(gè)重復(fù)。36 h后取出細(xì)胞，棄去瓶中的培養(yǎng)基，加入3 mL無菌的PBS緩沖液反復(fù)沖洗2遍，棄去PBS緩沖液，用胰酶消化細(xì)胞離心后棄去上清留細(xì)胞沉淀，用5 mL無菌PBS洗一遍后收集細(xì)胞，按照Western Blotting實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作。

1.2.5 Western Blotting檢測(cè)AMPK、mTOR、p-AMPK、p-mTOR、TSC1的表達(dá)水平 將INS-1細(xì)胞按70%匯合率接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)24 h貼壁后，按“1.2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組及藥物干預(yù)，每組3個(gè)重復(fù)。36 h后取出細(xì)胞，棄去瓶中的培養(yǎng)基，加入3 mL無菌的PBS緩沖液反復(fù)沖洗2遍，棄去PBS緩沖液，用胰酶消化細(xì)胞離心后棄去上清留細(xì)胞沉淀，用5 mL無菌PBS洗一遍后收集細(xì)胞，后續(xù)實(shí)驗(yàn)按照Western Blotting實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，多組間比較應(yīng)用單因素方差分析，方差齊時(shí)采用LSD法進(jìn)行組間多重比較，方差不齊時(shí)采用Dunnett's T3法進(jìn)行組間多重比較，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P ＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用GraphPad Prism 5.0軟件輔助作圖。

2 結(jié)果

2.1 昆侖雪菊水提物對(duì)棕櫚酸作用下INS-1細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常組相比，棕櫚酸組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)比值水平明顯降低（P ＜ 0.05），說明細(xì)胞自噬被抑制；與棕櫚酸組比較，昆侖雪菊水提物劑量依賴性的上調(diào)LC3-Ⅱ表達(dá)水平，降低LC3-Ⅰ表達(dá)水平，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯升高，表明細(xì)胞自噬被激活，且呈劑量依賴性，在10 μg·mL-1組作用最明顯（P ＜ 0.05）。具體結(jié)果見表1和圖1。

2.2 昆侖雪菊水提物對(duì)AMPK-mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵分子蛋白表達(dá)水平的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常組比，棕櫚酸組AMPK蛋白磷酸化水平明顯降低（P ＜ 0.05），mTOR蛋白磷酸化水平顯著升高（P ＜ 0.05），TSC1蛋白水平明顯降低（P ＜ 0.05）；與棕櫚酸組比較，昆侖雪菊水提物可以上調(diào)AMPK蛋白磷酸化水平，可顯著降低mTOR蛋白磷酸化水平，上調(diào)TSC1蛋白水平，其中10 μg·mL-1組作用最明顯（P ＜ 0.05）。說明昆侖雪菊水提物可通過激活A(yù)MPK-mTOR信號(hào)通路來激活細(xì)胞自噬。具體結(jié)果見表1、圖2。

2.3 AMPK抵制劑化合物C干預(yù)可逆轉(zhuǎn)昆侖雪菊水提物對(duì)AMPK-mTOR信號(hào)通路的調(diào)控作用

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與昆侖雪菊水提物+棕櫚酸組比較，AMPK抑制劑化合物C可以逆轉(zhuǎn)昆侖雪菊水提物對(duì)AMPK-mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵分子蛋白表達(dá)水平的調(diào)節(jié)作用（P ＜ 0.05）。詳見圖3。

3 討論

昆侖雪菊為新疆地產(chǎn)藥用植物資源，在民間多作茶飲，常用于改善高血壓、高血脂、糖尿病等慢性疾病。作為藥食兩用植物，其在食品保健、醫(yī)藥學(xué)等方面具有很大研究開發(fā)價(jià)值。本課題組前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)昆侖雪菊可以降低糖尿病動(dòng)物血糖，改善胰島素抵抗，提高胰島素敏感性，抗氧化和保護(hù)胰島細(xì)胞，對(duì)2型糖尿病具有一定的防治作用[8-9]。細(xì)胞水平研究發(fā)現(xiàn)昆侖雪菊水提物對(duì)高脂環(huán)境下的胰島β細(xì)胞有保護(hù)作用，能夠顯著抑制PA致INS-1細(xì)胞的損傷，且對(duì)INS-1細(xì)胞損傷的保護(hù)作用呈劑量依賴性[7]。但上述研究對(duì)昆侖雪菊降血糖和保護(hù)胰島β細(xì)胞的機(jī)制尚不清楚。

圖1 昆侖雪菊水提物對(duì)PA作用下INS-1細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白的影響A - Western Blotting法檢測(cè)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平，B - LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)水平的半定量分析注：與正常對(duì)照組比較，*P ＜ 0.05；與PA組比較，#P ＜ 0.05Fig 1 The effect of Kunlun coreopsis tinctoria aqueous extract on the LC3-Ⅱ / LC3-Ⅰ protein expression in INS-1 cells under the action of the PAA - Western Blotting method to detect LC3-Ⅱ /LC3-Ⅰ protein levels,B - LC3-Ⅱ /LC3-Ⅰ protein levels of half quantitative analysisNote: compared with control group, *P ＜ 0.05； compared with PA group, #P ＜ 0.05

表1 昆侖雪菊水提物對(duì)棕櫚酸作用下的INS-1細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響. ±s，n = 18Tab 1 Effect of Kunlun coreopsis tinctoria aqueous extract on the autophagy protein expression in INS-1 cells by palmitic acid.±s, n = 18

表1 昆侖雪菊水提物對(duì)棕櫚酸作用下的INS-1細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響. ±s，n = 18Tab 1 Effect of Kunlun coreopsis tinctoria aqueous extract on the autophagy protein expression in INS-1 cells by palmitic acid.±s, n = 18

注：與正常對(duì)照組比較，*P ＜ 0.05；與PA組比較，#P ＜ 0.05；與昆侖雪菊水提物（10 μg·mL-1）+ PA組比較，▲P ＜ 0.05Note: compared with control group, *P ＜ 0.05； compared with PA group, #P ＜ 0.05； compared with Kunlun coreopsis tinctoria aqueous extract (10 μg·mL-1) + PA group, ▲P ＜ 0.05

組別 LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ AMPK p-AMPK mTOR p-mTOR TSC1正常對(duì)照組 2.283±0.180 0.692±0.018 0.659±0.029 0.678±0.071 0.372±0.064 0.607±0.127 PA組 0.217±0.034* 0.708±0.069 0.388±0.051 0.731±0.090 0.830±0.070* 0.308±0.119*0.1 μg·mL-1昆侖雪菊水提物+PA組 0.342±0.066* 0.670±0.038 0.511±0.114 0.689±0.045 0.739±0.014* 0.371±0.162*5 μg·mL-1昆侖雪菊水提物+PA組 1.179±0.320*# 0.713±0.035 0.505±0.124 0.677±0.051 0.560±0.090*# 0.416±0.049 10 μg·mL-1昆侖雪菊水提物+PA組 2.170±0.363# 0.703±0.043 0.683±0.130# 0.680±0.086 0.439±0.070# 0.517±0.103#化合物C+10 μg·mL-1昆侖雪菊水提物+PA組1.188±0.051*#▲ 0.683±0.031 0.471±0.012*▲ 0.655±0.061 0.606±0.067*#▲ 0.300±0.098*▲

圖2 昆侖雪菊水提物對(duì)PA作用下INS-1細(xì)胞中AMPK-mTOR信號(hào)通路的影響A - Western Blotting法檢測(cè)p-AMPK、p-mTOR及TSC1蛋白水平，B - p-mTOR表達(dá)的半定量分析，C - p-AMPK表達(dá)的半定量分析，D -TSC1蛋白的半定量分析注：與正常對(duì)照組比較，*P ＜ 0.05；與PA組比較，#P ＜ 0.05Fig 2 The effect of Kunlun coreopsis tinctoria aqueous extract on the AMPK-mTOR pathway in INS-1 cells under the action of the PAA - Western Blotting method is used to detect p-AMPK, p-mTOR and TSC1 protein levels, B - Half quantitative analysis of p-mTOR protein levels,C - Half quantitative analysis of p-AMPK protein levels, D - Half quantitative analysis of TSC1 protein levelsNote: compared with control group, *P ＜ 0.05； compared with PA group, #P ＜ 0.05

圖3 AMPK抑制劑對(duì)AMPK-mTOR信號(hào)通路的影響A - Western Blotting法檢測(cè)p-AMPK、p-mTOR及TSC1蛋白水平，B - p-mTOR表達(dá)的半定量分析，C - p-AMPK表達(dá)的半定量分析，D -TSC1蛋白的半定量分析注：與正常對(duì)照組比較，*P ＜ 0.05；與PA組比較，#P ＜ 0.05；與昆侖雪菊水提物（10 μg·mL-1）+ PA組比較，▲P ＜ 0.05Fig 3 The effect of AMPK inhibitors on the AMPK-mTOR signaling pathwayA - Western Blotting method is used to detect p-AMPK、p-mTOR and TSC1 protein levels，B - Half quantitative analysis of p-mTOR protein levels，C - Half quantitative analysis of p-AMPK protein levels，D - Half quantitative analysis of TSC1 protein levelsNote: compared with control group, *P ＜ 0.05； compared with PA group, #P ＜ 0.05； compared with Kunlun coreopsis tinctoria aqueous extract (10 μg·mL-1) + PA group, ▲P ＜ 0.05

自噬是溶酶體降解受損的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)聚集體以及回收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的一種分解代謝的過程。眾多研究提示，自噬在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，胰島β細(xì)胞含量及胰島素抵抗等方面發(fā)揮重要作用[10-13]。自噬可以保護(hù)胰島β細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，維持胰島素的正常分泌和穩(wěn)態(tài)，減輕胰島β細(xì)胞氧化應(yīng)激，防止細(xì)胞凋亡以及清除泛素化蛋白聚集物等。說明自噬在糖尿病的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要作用，可能成為預(yù)防和治療糖尿病的一個(gè)新靶點(diǎn)[14]。因此本研究以自噬作為研究靶標(biāo)探討昆侖雪菊水提物對(duì)PA誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞損傷的保護(hù)作用機(jī)制。研究結(jié)果顯示，與PA對(duì)照組比較，昆侖雪菊水提物可劑量依賴性地上調(diào)自噬體標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值，提示昆侖雪菊水提物可激活細(xì)胞自噬。

AMPK-mTOR作為自噬過程中的重要調(diào)控途徑，在許多情況下，AMPK通過磷酸化激活ULK1進(jìn)而激活自噬聯(lián)級(jí)反應(yīng)，而mTOR則通過磷酸化抑制自噬的發(fā)生[15-17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，昆侖雪菊水提物明顯上調(diào)AMPK的磷酸化水平，同時(shí)抑制mTOR的磷酸化水平，上調(diào)TSC1蛋白表達(dá)水平。說明昆侖雪菊水提物可能通過調(diào)控AMPK-mTOR信號(hào)通路激活自噬的發(fā)生，進(jìn)而保護(hù)高脂環(huán)境下的胰島細(xì)胞。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，預(yù)先給予AMPK抑制劑化合物C處理INS-1細(xì)胞后，與昆侖雪菊水提物加PA組比較，此時(shí)p-AMPK表達(dá)水平明顯降低，而p-mTOR表達(dá)水平顯著增加，自噬相關(guān)蛋白TSC1表達(dá)明顯下調(diào)，說明昆侖雪菊水提物誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬被抑制。研究結(jié)果表明，昆侖雪菊水提物通過AMPK-mTOR信號(hào)通路激活細(xì)胞自噬，進(jìn)而發(fā)揮其抗脂毒性的胰島β細(xì)胞保護(hù)作用。

綜上所述，本研究探討了昆侖雪菊水提物對(duì)棕櫚酸作用下胰島β細(xì)胞損傷的保護(hù)作用機(jī)制，闡明昆侖雪菊水提物可通過調(diào)控AMPK-mTOR信號(hào)通路激活細(xì)胞自噬，進(jìn)而保護(hù)胰島β細(xì)胞的脂毒性損傷，從而為其在保護(hù)胰島細(xì)胞功能、防治糖尿病方面的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了實(shí)驗(yàn)和理論的支持。