蓋子環(huán)替換及定點(diǎn)突變提高菜豆環(huán)氧化物水解酶對(duì)鄰甲基苯基縮水甘油醚的催化性能

章晨，朱秀秀，李闖，鄔敏辰

（1 江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122；2 江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122；3 江南大學(xué)無(wú)錫醫(yī)學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122）

手性環(huán)氧化物是一類(lèi)重要的藥物砌塊，廣泛運(yùn)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥等領(lǐng)域[1]。如(S)-環(huán)氧苯乙烷是合成抗HIV 病毒藥、殺蟲(chóng)劑等的重要中間體[2]；(R)-oMGE 是合成β1-腎上腺素受體拮抗劑的重要原材料[3]。目前主要是通過(guò)化學(xué)合成以及生物酶催化拆分外消旋（racemic,rac-）環(huán)氧化物來(lái)獲取單構(gòu)型的環(huán)氧化物。化學(xué)合成中會(huì)使用大量的重金屬，不僅在生產(chǎn)中毒害大，也會(huì)對(duì)環(huán)境造成極大的破壞。相比之下，生物酶法由于其低毒性和經(jīng)濟(jì)性，被廣泛接受[4]。如環(huán)氧化物水解酶（epoxide hydrolases,EH,EC 3.3.2.-），能夠催化外消旋環(huán)氧化物對(duì)映或歸一性水解為相應(yīng)的鄰二醇，且廣泛存在于植物、動(dòng)物以及微生物體內(nèi)[5]。

近年來(lái)，環(huán)氧化物水解酶的挖掘及改造已成為研究熱點(diǎn)。如許建和團(tuán)隊(duì)[6-7]從綠豆中擴(kuò)增出2條編碼EH 的基因，并導(dǎo)入大腸桿菌（Escherchia coli，E.coli），成功地實(shí)現(xiàn)了植物來(lái)源環(huán)氧化物的異源表達(dá)，所得的重組酶VrEH1和VrEH2能對(duì)映歸一性水解對(duì)硝基環(huán)氧苯乙烷，生成的(R)-對(duì)硝基苯乙二醇的對(duì)映體過(guò)量值（enantiomeric excess，ee）分別為70.0%和84.8%。又如朱勍團(tuán)隊(duì)[8]從蘋(píng)果輪紋病菌中挖掘出一種EH，能夠動(dòng)力學(xué)拆分苯基縮水甘油醚類(lèi)環(huán)氧化物，其中，對(duì)rac-oMGE對(duì)映體比率（enantiomeric ratio，E）達(dá)到48.6。但目前發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)野生EH因?yàn)镋、ee或活性低等原因，無(wú)法滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求。隨著蛋白質(zhì)分子改造技術(shù)的日益成熟，改造EH 從而改善其性質(zhì)的研究也屢見(jiàn)報(bào)道。如Reetz等[9]通過(guò)定點(diǎn)飽和突變技術(shù)將一種黑曲霉EH 對(duì)rac-oMGE的E值由4.6提高到160。

實(shí)驗(yàn)室前期從菜豆中挖掘出兩種菜豆環(huán)氧化物水解酶PvEH1和PvEH2，均能對(duì)映選擇性水解racoMGE[9]。現(xiàn)擬通過(guò)分子改造提高PvEH2 的催化性能，使其水解rac-oMGE 時(shí)既能保留單構(gòu)型環(huán)氧化物，又能生成較純的單構(gòu)型鄰二醇。先同源模擬PvEH1 和PvEH2 的三維結(jié)構(gòu)，然后替換PvEH2 分子結(jié)構(gòu)中的蓋子環(huán)區(qū)域，再利用分子對(duì)接技術(shù)選取距離底物8?（1?=0.1nm）以內(nèi)的非保守氨基酸，將其全部突變?yōu)楸彼幔玫搅艘粋€(gè)最優(yōu)突變子Pv2Pv1K176A，并采用分子對(duì)接模擬分析其區(qū)域選擇性提高的原因，最后用E. coli/pv2pv1K176A催化高濃度rac-oMGE。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

E. coli BL（DE3）和E. coli JM109，保存于本實(shí)驗(yàn)室；克隆質(zhì)粒pUCm-T，上海Sangon公司；表達(dá)質(zhì)粒pCold Ⅱ，美國(guó)Novagen公司。

1.2 試劑與儀器

1L LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g和NaCl 10g（固體培養(yǎng)基另加20g 瓊脂粉），pH 調(diào)至7.0。質(zhì)粒提取試劑盒（無(wú)錫康為世紀(jì)公司）。rac-oMGE（上海TCI 公司）。全溫?fù)u瓶柜HYG-A（江蘇太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；高速冷凍離心機(jī)5804R（德國(guó)Eppendorf 公司）；實(shí)驗(yàn)所用酶均購(gòu)于上海Sangon生物技術(shù)有限公司。液相色譜OD-H手性柱（250mm×4.6mm×5μm）購(gòu)自大賽璐藥物手性技術(shù)（上海）有限公司。

1.3 PvEH2的結(jié)構(gòu)分析

在Swiss-Prot Protein 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ebi.ac.uk/swissprot/）中搜索與PvEH2 同源性最高且結(jié)構(gòu)和功能已知的蛋白分子，以此蛋白三維結(jié)構(gòu)為模板在SWISS-MODEL 網(wǎng) 站（https://swissmodel.expasy.org/）中模擬出PvEH1和PvEH2的三維結(jié)構(gòu)。利用PyMOL軟件（https://pymol.org/2/）對(duì)它們的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化分析。

表1 FPCR所用引物

1.4 PvEH2的蓋子環(huán)替換

本節(jié)所用引物如表1所示，由無(wú)錫亦欣生物公司合成。提取含有PvEH2 編碼基因的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒（pCold Ⅱ-pveh2），并作為模板，通過(guò)三輪融合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（FPCR）獲得目的基因pv2pv1。第一輪以pveh2-F 和pv1pv2-R 作為引物，在DNA聚合酶PrimerSTAR HS DNA polymerase作用下進(jìn)行PCR：98℃變性3min，30 個(gè)循環(huán)（98℃，30s；50℃，30s和72℃，40s），72℃充分延伸10min，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并割膠回收。再以回收產(chǎn)物為模板，pveh2-R 和pv2pv1-F 為第二輪引物，其他條件不變進(jìn)行擴(kuò)增、檢測(cè)和割膠。最后以第一輪和第二輪產(chǎn)物作為第三輪PCR 的上下模板，pveh2-F和pveh2-R為引物，其他條件不變，獲得蓋子環(huán)被替換的EH 編碼基因pv2pv1。連接pUCm-T 載體，轉(zhuǎn)化E. coli JM109 并用氨芐西林（Amp）篩選陽(yáng)性克隆子送至上海Sangon 生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA 測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序成功的轉(zhuǎn)化子命名為pUCm-T-pv2pv1，用Nde I 和Sal I 雙酶切，最終連接至pCold Ⅱ，轉(zhuǎn)入E. coli BL21（DE3），經(jīng)Amp 抗性篩選、驗(yàn)證并且測(cè)序正確的重組菌株命名為E.coli/pv2pv1。

1.5 全細(xì)胞酶的誘導(dǎo)及催化特性分析

將獲得的菌接種（接種量為1%）于2mL含0.1μg/L Amp 的LB 培養(yǎng)基中，于37℃、220r/min 條件下培養(yǎng)過(guò)夜；取2mL 培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于100mL 含0.1μg/L Amp 的LB 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600（在600nm 波長(zhǎng)處的吸光值）為0.6～0.8時(shí)，加入0.1mL 500mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG） 至終濃度為0.5mmol/L，14℃誘導(dǎo)16h后離心收集濕菌體。

稱(chēng)取0.1g 濕菌體懸浮于1mL 磷酸鈉緩沖液（100mmol/L，pH=7.0）中，取0.3mL 100g/L菌懸液加到含0.65mL磷酸鈉緩沖液的2mL 環(huán)氧樹(shù)脂（EP）管中，20℃孵育5min 后加入50μL rac-oMGE（200 mmol/L，溶劑為甲醇）至終濃度為10mmol/L，20℃恒溫震蕩反應(yīng)10min，取150μL 樣品用1mL 乙酸乙酯萃取，有機(jī)相經(jīng)無(wú)水硫酸鎂干燥。樣品采用高效液相色譜儀（Waterse2695）、手性液相色譜柱（OD-H）和紫外檢測(cè)器（Waters2489）進(jìn)行分析。高效液相色譜條件為：流動(dòng)相為正己烷∶異丙醇=80∶20（體積比），柱溫30℃，流速為0.8mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm。(R)-oMGE、(S)-oMGE、(R)-oTPD和(S)-oTPD 的保留時(shí)間分別為6.69min、8.03min、8.83min和9.82min。

在上述測(cè)定條件下，酶活單位（U）定義為每分鐘消耗1μmol 的rac-oMGE 所需的酶量。全細(xì)胞比活力（U/g）計(jì)算公式如活性=C0×v×c/(t×m)所示。其中c為全細(xì)胞催化rac-oMGE的轉(zhuǎn)化率，%；C0為底物初始濃度，mmol/L；t 為反應(yīng)時(shí)間，min；v 為反應(yīng)體積，mL；m為濕細(xì)胞質(zhì)量，g。

底物的ees=(RS-SS)/(RS+SS)×100% 和產(chǎn)物eep=(SP-RP)/(SP+RP)×100%。其中RS和SS分別代表(R)-oMGE和(S)-oMGE的峰面積；RP和SP表示(R)-oTPD和(S)-oTPD 的峰面積。酶的對(duì)映選擇性用E 來(lái)評(píng)價(jià)，E=ln[(1-c)(1-ees)]/ln[(1-c)(1+ees)]，E值越高，則對(duì)映選擇性越高[10]。

區(qū)域選擇性系數(shù)αS和βR（圖1）可由線性回歸方程eep=(βS-αR)×ees×(1-c)/c+αR+βS-1進(jìn)行計(jì)算[11]。eep和ees×(1-c)/c 定義為因變量和自變量。通過(guò)測(cè)定酶催化rac-oMGE 水解過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)的c、ees和eep，對(duì)上述線性方程進(jìn)行擬合，從而算得αR，βS。

1.6 Pv2Pv1的丙氨酸突變

圖1 區(qū)域選擇性的示意圖

將Pv2Pv1 和另外4 種植物來(lái)源的EH 的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源序列比對(duì)，找出非保守氨基酸（同源性≤60%）。根據(jù)1.3節(jié)方法對(duì)Pv2Pv1同源建模，再通過(guò)AutoDock4.2 軟 件（http://autodock.scripps.edu）進(jìn)行分子對(duì)接，用PyMOL 找出距離(R)-oMGE 8?以內(nèi)的非保守氨基酸，并通過(guò)兩輪全質(zhì)粒PCR 將這些氨基酸突變?yōu)楸彼幔ˋ）。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)突變引物[10]。一輪PCR所用的上游引物為設(shè)計(jì)的突變引物，下游引物為通用引物pCold Ⅱ-R，預(yù)變性95℃，4min；變性98℃，10s；退火55℃，5s；延伸72℃，1min；從變性到延伸循環(huán)30 次，最后充分延伸，72℃，10min。二輪PCR 以一輪PCR 產(chǎn)物為引物，全質(zhì)粒為模板，除延伸時(shí)間變?yōu)?min，其他條件同第一輪。產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶DpnI 消化后導(dǎo)入E. coli BL21（DE3），培養(yǎng)12h 后對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，并對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果正確的轉(zhuǎn)化子命名為E.coli/pv2pv1突變位點(diǎn)。

1.7 分子對(duì)接分析

用ChemDraw Ultra 12.0 軟 件 （http://www.cambridgesoft.com/）構(gòu)建(R)-oMGE的三維結(jié)構(gòu)。參照1.3 節(jié)方法模擬Pv2Pv1 和Pv2Pv1K76A的三維結(jié)構(gòu)模 型。采 用AutoDock 4.2 將PvEH2、Pv2Pv1 和Pv2Pv1K76A分別與(R)-oMGE 進(jìn)行分子對(duì)接，通過(guò)Gromacs（http://www.gromacs.org/）進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，將生成的結(jié)合能最低的構(gòu)象作為最佳構(gòu)象，用PyMOL分析所得構(gòu)象。

1.8 E.coli/pv2pv1K76A水解高濃度rac-oMGE

為了確定E.coli/pv2pv1K76A水解動(dòng)力學(xué)拆分racoMGE的最大濃度，在10mL EP管中，用200mg/mL的E.coli/pv2pv1K76A催化不同濃度（80～180mmol/L）的rac-oMGE，反應(yīng)體系2mL，25℃反應(yīng)2～8h。測(cè)定ees、eep、YP和YS。在確定最大反應(yīng)濃度后，放大反應(yīng)體系至10mL，在25℃條件下用200mg/mL的E.coli/pv2pv1K76A水解150mmol/L 的rac-oMGE，定時(shí)進(jìn)行取樣監(jiān)測(cè)，參照方法1.5用HPLC測(cè)定殘余的(R)-oMGE、(S)-oMGE 及生成的(R)-oTPD、(S)-oTPD 的濃度，并計(jì)算ees、eep、YP和YS，繪制反應(yīng)進(jìn)程曲線，同時(shí)計(jì)算時(shí)空產(chǎn)率[space-time yield, STY，表示在一定的反應(yīng)條件下，單位體積單位時(shí)間獲得目的產(chǎn)物總量，g/(L·h)[11]]。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 PvEH2和PvEH1的三維結(jié)構(gòu)分析

實(shí)驗(yàn)室前期挖掘了兩種菜豆環(huán)氧化物水解酶，PvEH1 和PvEH2，它們均能對(duì)映選擇性水解racoMGE，優(yōu)先水解S構(gòu)型，保留R構(gòu)型。當(dāng)S構(gòu)型的底物水解完全時(shí)（ees＞99%），所生成的(S)-oTPD的eep僅有8.3%和53.6%，其中全細(xì)胞酶E. coli/pveh1 對(duì)rac-oMGE 的活性為157.2U/g，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于E.coli/pveh2的4.1U/g[12-13]。

以PvEH2一級(jí)結(jié)構(gòu)為模板，在SWISS-MODEL網(wǎng)站找到一個(gè)同源性最高（80.06%）且功能已知的綠豆環(huán)氧化物水解酶（VrEH1，PDB∶5XMD.2），并以它為模板模擬PvEH2、PvEH1的三維結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，PvEH2 和PvEH1 均屬于α/β 水解酶家族，催化三聯(lián)體為Asp-His-Asp 和兩個(gè)Tyr 質(zhì)子供體分別位于中心結(jié)構(gòu)域和蓋子結(jié)構(gòu)域（圖2）。其中蓋子環(huán)是蓋子結(jié)構(gòu)域中的一段可變環(huán)，在不同的EH中，它的結(jié)構(gòu)差異很大，因而對(duì)EH的催化性質(zhì)影響很大[14]。PvEH2和PvEH1的蓋子環(huán)在結(jié)構(gòu)上有很大的差異，如圖2(b)。基于全細(xì)胞酶E.coli/pveh1的高酶活，期望通過(guò)蓋子環(huán)替換改善E.coli/pveh2 的酶活及其他催化性質(zhì)。

圖2 PvEH1和PvEH2的三維模擬結(jié)構(gòu)比對(duì)

表2 E.coli/pveh2及/pveh2cl1的相關(guān)催化性質(zhì)

2.2 Pv2Pv1的催化性質(zhì)分析

按1.4 節(jié)方法獲得了重組菌E. coli/pv2pv1，誘導(dǎo)表達(dá)收菌后，按1.5 節(jié)方法對(duì)其相關(guān)催化性質(zhì)進(jìn)行分析，其活性幾乎沒(méi)有發(fā)生變化，E值由23.0下降到15.1，當(dāng)?shù)孜锏膃es＞99%時(shí)，其產(chǎn)物(S)-oTPD的eep由E. coli/pveh2 的58.3%提高到75.5%，通過(guò)對(duì)區(qū)域選擇性系數(shù)的分析發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因是αR由3.8%提升至42.4%。保留的(R)-oMGE 的產(chǎn)率（Ys） 有所降低，但是產(chǎn)物(S)-oTPD 的產(chǎn)率（Yp）由42.9%提高至58.4%（表2）。表明蓋子環(huán)替換后的Pv2Pv1，有一定的能力使(R)-oMGE 翻轉(zhuǎn)生成(S)-oTPD。

2.3 丙氨酸突變位點(diǎn)的選擇

運(yùn) 用AutoDock 4.2 對(duì)Pv2Pv1 和(R)-oMGE 進(jìn) 行分子對(duì)接，其結(jié)果如圖3(a)所示。距離底物8? 以內(nèi)的氨基酸殘基共計(jì)有32個(gè)[圖3(c)中“*”表示]。與其他4 種植物來(lái)源的EH 序列比對(duì)，除去包括催化三聯(lián)體和兩個(gè)質(zhì)子供體在內(nèi)的17個(gè)保守位點(diǎn)和4個(gè)相對(duì)保守位點(diǎn)，一共有11 個(gè)非保守氨基酸位點(diǎn)：

I105、W129、P137、K175、L176A、N179、L187、P203、I238、S266 和M273[圖3(b)]。據(jù)報(bào)道，突變EH中的非保守氨基酸，能很好地改善其催化性質(zhì)，如Li等[14]通過(guò)突變PvEH3中的非保守氨基酸，將產(chǎn)物對(duì)氯苯基乙二醇的eep由85.1%提高至93.2%，Kong等[15]通過(guò)在BmEH的催化活性中心附近進(jìn)行丙氨酸突變，大大地提高了其對(duì)α-萘基縮水甘油醚的活性和對(duì)映選擇性。因此，本研究選擇將以上11個(gè)非保守氨基酸突變?yōu)楸彼帷?/p>

2.4 丙氨酸突變子的催化特性分析

按1.6節(jié)方法獲得11個(gè)丙氨酸突變子，用全細(xì)胞催化反應(yīng)，按1.5 節(jié)方法測(cè)定各突變子對(duì)racoMGE 的催化特性。如表3 所示，11 個(gè)突變子中，E.coli/pv2pv1K176A的催化性能綜合表現(xiàn)最為優(yōu)越，與E.coli/pv2pv1 相比，催化性能得到明顯提升，活性由4.2U/g提高至8.7U/g，提高了2.1倍。當(dāng)S構(gòu)型的底物剛好反應(yīng)完全時(shí)，R 構(gòu)型的鄰二醇的eep由75.5% 提高至80.3%，產(chǎn)率也由58.4% 提高至61.9%。經(jīng)測(cè)定，區(qū)域選擇性系數(shù)βS=4.6%，αR=52.2%，αR相對(duì)于Pv2Pv1提高了9.8%。

表3 丙氨酸突變子對(duì)rac-oMGE的催化特性分析

2.5 分子對(duì)接分析區(qū)域選擇性提高原理

為了從分子水平了解Pv2Pv1及Pv2Pv1K176A區(qū)域選擇性系數(shù)αR提高的原理，運(yùn)用AutoDock 4.2 將PvEH2、Pv2Pv1、Pv2Pv1K176A與(R)-oMGE 進(jìn) 行 對(duì)接，對(duì)接后的局部放大圖如圖4。根據(jù)Reetz等[16-17]關(guān)于EH催化機(jī)理的研究：位于活性中心的天冬氨酸的O原子通過(guò)攻擊環(huán)氧環(huán)上的C原子，從而使環(huán)氧環(huán)斷開(kāi)，其中，天冬氨酸中的氧到環(huán)氧環(huán)中Cα原子的空間距離dα是一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)，dα越短，Cα越容易受到O 原子的攻擊，其αR值越大。PvEH2 的dα=4.5?，經(jīng)過(guò)蓋子環(huán)的替換后，dα變?yōu)?.1?，在上述的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)中，其對(duì)應(yīng)的αR值由3.8%提高到42.4%，丙氨酸突變后dα進(jìn)一步縮短為2.9?，αR進(jìn)一步變?yōu)?2.2%。對(duì)接分析結(jié)果和實(shí)驗(yàn)測(cè)量結(jié)果相符。

2.6 E.coli/pv2pv1K176A水解高濃度rac-oMGE

為確定E.coli/pv2pv1K176A能水解rac-oMGE 的最大濃度，使用200mg/mL菌懸液分別拆分80mmol/L、100mmol/L、120mmol/L、150mmol/L 和180mmol/L的rac-oMGE。當(dāng)E. coli/pv2pv1K176A水解150mmol/L的rac-oMGE時(shí)，5.0h水解完全，得到(R)-oMGE和(S)-oTPD 的產(chǎn)率YS和YP分別為32.5%和59.1%，相應(yīng)對(duì)應(yīng)體純度ees＞99%，eep=80.9%。由于EH 存在底物或產(chǎn)物抑制的現(xiàn)象[4]，當(dāng)rac-oMGE 的濃度達(dá)到180mmol/L 時(shí)，即使反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)至8.0h，ees仍然僅為70.3%。因此，確定E. coli/pv2pv1K176A水解rac-oMGE的最大底物濃度為150mmol/L。

圖3 Pv2Pv1與4種植物EH一級(jí)結(jié)構(gòu)的多序列比對(duì)

圖4 PvEH2、Pv2Pv1和Pv2Pv1K176AL與（R）-oMGE的分子對(duì)接模擬（1?=0.1nm）

用200mg/mL E. coli/pv2pv1K176A在10mL 體系中水解150mmol/L rac-oMGE。其水解反應(yīng)進(jìn)程圖5所示。在反應(yīng)5.0h 后，(S)-oMGE 完全水解完（ees＞99%），得到(R)-oMGE的產(chǎn)率為32.5%，高于AnEH的29%，但低于TlEH 的40%，得到(R)-oMGE 的產(chǎn)率為32.7%，高于AnEH的29%，但低于TlEH的40%，STY為1.6g/(L·h)，分別是AnEH和TlEH的6.7和2.4倍。(S)-oTPD 的產(chǎn)率為60.1%，eep為80.4%，均高于TlEH，STY為3.3g/(L·h)，是TlEH的3.5倍[18-19]。

圖5 200mg/mL E.coli/pv2pv1K176A水解150mmol/L rac-oMGE的進(jìn)程圖

3 結(jié)論

（1）本研究通過(guò)FPCR，構(gòu)建了一種蓋子環(huán)替換的雜合酶Pv2Pv1，通過(guò)分析其催化性質(zhì)，Pv2Pv1在水解rac-oMGE時(shí)，當(dāng)S構(gòu)型的底物水解完全時(shí)，得到的產(chǎn)物(S)-oTPD的產(chǎn)率和eep都有明顯升高。

（2）獲得11 個(gè)丙氨酸突變子，其中，E. coli/pv2pv1K176的酶活，(S)-oTPD的產(chǎn)率，eep都有進(jìn)一步的提升。通過(guò)分子對(duì)接分析發(fā)現(xiàn)相對(duì)于PvEH2 和Pv2Pv1，Pv2Pv1K176有著最短的dα，從而解釋了其區(qū)域選擇性系數(shù)αR提高的原因。

（3）用E.coli/pv2pv1K176水解高濃度rac-oMGE，發(fā)現(xiàn)其具有應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的潛能，同時(shí)該酶也存在一定的缺陷，如酶活和產(chǎn)物(S)-oTPD 的eep還有進(jìn)一步的提升空間，今后可以通過(guò)定向進(jìn)化的手段對(duì)其催化性能進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化和改造。