冠心病患者ABCA1基因多態性及血清FABP3水平聯合檢測與冠狀動脈血管病變的相關性研究

歐陽春，韓 振，葉小強，黃 磊

（北京大學深圳醫院心血管外科，廣東深圳 518036）

冠狀動脈性心臟?。╟oronary heart disease，CHD）是臨床動脈粥樣硬化中常見的心血管性疾病之一，主要為冠狀動脈發生粥樣硬化或血管痙攣導致血管腔狹窄或阻塞，導致心肌暫時性缺血缺氧或心肌梗死的心血管疾病[1]。據統計[2]，在我國15歲以上人群中，冠心病在城市、農村及城鄉結合地區的患病率分別為1.2%，0.8%和1%，且因冠心病死亡患者所占比例在所有心血管疾病中約為37%。有研究表明[3-5]，大部分冠心病患者具有明顯的家族遺傳病史，發病具有家族聚集性的特點，其中三磷酸腺苷結合盒轉運體A1（ATP binding cassette subfamily A member 1，ABCA1）對機體膽固醇的轉運和高密度脂蛋白的形成發揮重要作用，而編碼該蛋白的基因與冠心病的發病具有密切關系。有研究發現[6-7]，脂肪酸結合蛋白3（fatty acid binding proteins 3，FABP3）作為一種主要存在于心肌細胞中的蛋白，在缺血、缺氧時可迅速釋放入血，可作為心肌梗死的一種重要標志物。但目前，對ABCA1基因多態性聯合FABP3對于預測多支血管病變的穩定期冠心病尚未見報道。本研究擬初步探討ABCA1基因多態性聯合FABP3對冠狀動脈多支血管病變的預測價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2018年11月～2019年11月期間在我院心內科住院治療的237例冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者作為研究對象，根據患者冠狀動脈造影結果，按照病變血管支數，將患者分為單支病變組（n=101）和多支病變組（n=136）。入選標準：①患者診斷符合中華醫學會制定的《穩定性冠心病診斷與治療指南》，且冠狀動脈狹窄診斷的影像學檢查明確，即存在主要冠狀動脈、右冠狀動脈及其粗大分支中至少有一支血管管腔的狹窄程度≥70%；②患者年齡≥18周歲，男女不限，自愿參與本研究并簽訂知情同意書；③患者住院期間臨床資料準確完整。排除標準：①患者伴有嚴重的基礎疾病如肝腎功能障礙性疾病、慢性心力衰竭或惡性腫瘤疾病等；②患者并發有精神性疾病病史。

1.2 試劑與儀器 本研究所涉及的主要試劑有DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；血清FABP3檢測試劑盒（上海康朗生物科技有限公司）；瓊脂糖，三羥甲基氨基甲烷（美國Promega公司）；硼酸，純凈水（生工生物工程上海股份有限公司）；SAP緩沖液（上海聯邁生物工程有限公司）。使用的主要儀器有微量分光光度計（北京凱奧科技發展有限公司）；高壓電泳儀（君意東方電泳設備有限公司）；電子分析天平（上海皓拂儀器儀表有限公司）；臺式離心機（上海醫用分析儀器廠）。

1.3 研究方法

1.3.1 ABCA1基因測序

1.3.1.1 ABCA1基因突變位點的選擇：采用實時熒光定量PCR方法，對可能與冠心病相關的ABCA1基因4個常見突變位點進行檢測，突變位點信息詳見表1。

1.3.1.2 基因組DNA的提取：采用北京天根生化科技有限公司生產的血液基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）對入組患者的血樣進行DNA提取。

表1 ABCA1基因4個突變位點信息

1.3.1.3 DNA含量和純度檢測：使用北京凱奧科技發展有限公司生產的K5600超微量分光光度計分別檢測260nm和280nm兩處波長下DNA樣品的吸光度值，對DNA含量檢測。DNA樣品濃度采用Lambert-Beer定律進行計算，采用A260mm/A280mm比值評價DNA樣品純度。

1.3.1.4 引物設計：見表2。采用Assay design3.1軟件設計上述4個位點在聚合酶鏈反應所需的引物。

表2 4個突變位點的引物設計

1.3.2 Hard-Weinberg平衡檢驗：為考察研究樣本是否具有良好的代表性，對兩組患者ABCA1基因4個突變位點發生頻率采用卡方檢驗判斷是否符合Hard-Weinberg平衡，若P值大于0.05，則認為該研究群體處于Hard-Weinberg平衡狀態。

1.3.3 FABP3等生化指標檢測：采用雙抗體夾心ELISA法，使用FABP3檢測試劑盒（上?？道噬锟萍加邢薰?，中國）檢測血清FABP3水平。采用全自動生化分析儀（ADVIA2400，西門子醫療系統有限公司，德國）檢測患者總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）及空腹血葡萄糖（fasting blood glucose，FPG）。

1.4 統計學分析 本研究中采用SPSS21.0軟件進行統計學分析。計量資料以均值±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料以頻數和百分比表示，組間比較采用卡方檢驗。檢驗水準設定為0.05，即當P＜0.05時為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 患者一般臨床資料比較 見表2。本研究共納入237例冠狀粥樣硬化性心臟病患者，根據冠狀動脈造影檢查結果，單支病變患者101例（42.6%），多支病變患者136例（57.4%）。兩組間在性別、年齡、體重指數（body mass index，BMI），TC，TG，HDL-C及LDL-C等指標上差異無統計學意義。多支病變組FABP3水平高于單支病變組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表2 單支病變組和多支病變組患者一般情況比較

2.2 Hard-Weinberg平衡檢驗 見表3。采用擬合優度χ2檢驗對單支病變組和多支病變組患者的ABCA1基因4個位點的基因型分布進行檢驗，結果顯示，兩組患者4個多態性位點的基因型頻率分布符合Hard-Weinberg平衡（P＞0.05），因此，可以認為本次研究對象的群體代表性較好。

表3 Hard-Weinberg平衡檢驗

2.3 ABCA1基因突變頻率比較分析 見表4。對兩組患者ABCA1基因的4個位點進行檢測，經χ2檢驗，單支病變組和多支病變組中僅rs363717突變位點基因型和等位基因頻數差異具有統計學意義（P＜0.05）。

2.4 兩組患者FABP3水平比較 采用t檢驗對兩組患者FABP3水平進行比較，結果發現多支病變組患者FABP3水平（2 946.53±453.59pg/ml）高于單支病變組患者（2 249.50±603.21pg/ml），差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表4 ABCA1基因4個位點的基因型和等位基因頻數分布比較[n（%）]

2.5 Logistic回歸分析結果 見表5。對患者ABCA1基因rs363717位點及FABP3水平進行Logistic回歸分析。結果表明，高水平FABP3（OR=1.003，95%CI：1.002～1.003）是冠心病患者發生多支血管病變的主要危險因素，而ABCA1基因rs363717位點突變（OR=0.511，95%CI：0.296～0.884）則是冠心病患者發生多支血管病變的保護性因素，結果具有統計學差異（P＜0.05）。

表5 Logistic回歸分析結果

2.6 FABP3及rs363717位點突變對冠狀動脈多支血管病變的預測價值 見圖1，表6。ROC曲線顯示，FABP3曲線下面積（AUC）為0.518 (95% CI：0.439～0.596，P=0.642)，經計算最佳臨界值為2 449.1 pg/ml，rs363717位點突變曲線下面積（AUC）為0.854(95% CI：0.805～0.903，P＜0.01)。

表6 FABP3及rs363717位點突變預測能力的曲線下面積

圖1 FABP3及 rs363717位點突變預測能力的ROC分析曲線

3 討論

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是一種累及整個冠狀動脈系統的慢性心臟疾病，根據冠狀動脈造影檢查，臨床中?？砂凑詹∽兊睦奂胺秶统潭?，將其分為單支病變和多支病變[8]。有研究表明[5,9-10]，多支血管病變的冠心病患者中，其冠狀動脈血管壁的斑塊負荷更加嚴重，疾病的治療和預后與單支病變患者具有一定差異。因此，如何在治療早期即對冠心病患者單支和多支病變進行預測和判斷，對分析血管病變和冠狀動脈血管缺血事件的關系，選擇恰當的治療手段，最大程度地改善患者預后具有重要意義。

FABP3主要存在于心肌組織，由132個氨基酸殘基組成[11]。研究表明[6]，冠心病患者體內血清FABP3水平顯著高于健康受試者，其原因是在心肌細胞發生缺血、缺氧等損傷時，FABP3可通過受損的細胞膜大量釋放入血。本研究結果提示，單支血管病變的冠心病患者FABP3水平顯著低于多支病變患者，這表明FABP3的血清水平可能反映了冠心病患者血管累及范圍和程度。與周夢迪等[14]研究結果類似，該研究顯示患者血清中FABP3水平隨著冠狀動脈病變范圍和累及支數的增加而升高，因此認為FABP3血清水平與心肌梗死患者冠狀動脈病變的嚴重程度和累及范圍呈正相關。分析其機制可能與下列因素有關：①影響心肌細胞的能量代謝。FABP3可為細胞提供能量，參與到心肌脂肪酸的能量代謝過程中，當FABP3基因表達被抑制時心肌細胞內ATP合成顯著減少[13]；②FABP3可減輕機體內的氧化應激反應。當心肌細胞由于長時間內缺血、缺氧可引起長鏈脂肪酸和乙酰輔酶A等產生氧自由基的物質聚集，加重心肌細胞氧化應激，而FABP3具有清除氧自由基的功能，可通過減少心肌細胞膜受脂質等衍生物的毒性作用達到減少氧化應激反應的作用[14]；③FABP3與細胞凋亡有關。有研究表明[12]，抑制FABP3基因表達可誘發心肌細胞凋亡。根據以上情況推斷，當冠心病患者冠狀動脈病變支數增加，血管狹窄程度更重時，心肌細胞缺血缺氧的數量不斷增加，從而進一步加重氧化應激反應，影響能量代謝，導致FABP3釋放入血，使其在血清中水平迅速升高。

ABCA1在體內主要參與體內HDL-C的形成以及膽固醇的逆向轉運過程，對降低血液中膽固醇起到促進作用[15]。有研究表明[16]，ABCA1基因多態性與冠心病的發生具有一定關系。本研究發現，單支病變組rs363717位點野生型患者顯著低于多支病變組，而雜合突變的患者則高于多支病變組，這提示rs363717多態性位點的A等位基因很可能是冠心病的致病因素。位于3’UTR非編碼區的rs363717突變位點發生堿基突變后可導致ABCA1基因編碼的蛋白質結構發生變化，從而影響mRNA的穩定性，并對mRN和miRNA的相互作用產生影響。有研究表明[17]，ABCA1基因rs363717位點突變降低冠心病的易感性可能是通過阻礙mRNA和miRNA互補結合并增加mRNA的穩定性而發揮作用。與我國學者楊博[18]的研究結果類似，該研究發現，當rs363717位點的等位基因A突變為G時，冠心病的發病風險降低，從而認為等位基因G是冠心病的保護因素。

綜上所述，本研究結果發現單支病變組和多支病變組患者在FABP3水平和ABCA1基因rs363717基因位點突變上具有顯著性差異。FABP3水平升高以及ABCA1基因rs363717基因位點為AA的患者是發生多支血管病變的獨立危險因子，對預測冠狀動脈多支血管病變具有一定臨床價值，但由于樣本量有限，還需要擴大樣本量進一步研究證實。