巨幼紅細(xì)胞性貧血患者血漿維生素B9和維生素B12水平對骨髓組織p53表達(dá)的影響研究

張 蓉，李國輝，王 穎，劉 贊，趙會迎，梁英民

（1.西安高新醫(yī)院血液科,西安 710065；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院血液科，西安 710038）

巨幼紅細(xì)胞性貧血(megaloblastic anemia,MBA)又稱巨細(xì)胞性貧血，其特征是紅細(xì)胞數(shù)量減少，以及存在體積異常和發(fā)育不良的紅細(xì)胞(巨母細(xì)胞)。由于該類紅細(xì)胞體積較大，無法進(jìn)入血液循環(huán)[1]。MBA主要與葉酸(VB9)或維生素B12(VB12)的缺乏相關(guān)，具體而言，由于抑制前紅細(xì)胞DNA的合成和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而阻礙向網(wǎng)織紅細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致全血細(xì)胞的減少[2-3]。然而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子之一是p53，其可以通過保護(hù)DNA和核苷酸以發(fā)揮維持遺傳物質(zhì)的完整性的作用[4]。因此，本研究旨在探究MBA患者血漿中VB9和VB12水平對p53表達(dá)的影響?，F(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 研究對象 選擇2015年3月～2018年5月西安高新醫(yī)院68例MBA患者為病例組，另選取同期68例健康者為對照組。兩組的一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。所有研究對象均自愿參加且簽署知情同意書，本研究經(jīng)由我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：參照WHO中關(guān)于巨幼紅細(xì)胞性貧血的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，確診為MBA者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：精神疾病者、全身免疫性疾病者、并發(fā)惡性腫瘤者。

1.2 儀器與試劑 采用同型半胱氨酸測定試劑盒(bsk00589，博奧森)，VB9測定試劑盒（JL47806，江萊生物），VB12測定試劑盒（JL11843，江萊生物)分別對血漿中同型半胱氨酸濃度(2.5～80μmol/L)，VB9(5.00～5.90ng/ml)和VB12(124.00～201.00pg/ml)進(jìn)行測定。采用免疫組化法分析骨髓標(biāo)本石蠟包埋塊p53的表達(dá)情況，具體操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行[6]。

1.3 方法 探究兩組VB9和VB12的分布情況。

比較p53在不同程度VB9和VB12分布中的表達(dá)水平。免疫組化結(jié)果按照染色強(qiáng)度進(jìn)行判斷，輕度染色表示著色細(xì)胞陽性率＜10%；中度染色表示著色細(xì)胞陽性率10%～50%；重度染色表示著色細(xì)胞陽性率＞50%。未染色和輕度染色視為結(jié)果陰性，中度和重度染色視為結(jié)果陽性。

比較兩組間同型半胱氨酸的含量和分布情況。

低VB9和VB12的MBA患者同型半胱氨酸的含量與p53表達(dá)的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計數(shù)資料以n(%)表示。兩組間比較采用Student’st檢驗。采用線性回歸分析兩連續(xù)變量之間的線性關(guān)聯(lián)性。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般情況及VB9，VB12及p53水平比較 見表1。對照組VB9，VB12及p53水平均高于病例組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表 1 病例組及對照組VB9，VB12及p53水平比較（±s）

表 1 病例組及對照組VB9，VB12及p53水平比較（±s）

項 目 病例組 對照組 t P VB9(ng/ml) 5.28±0.36 5.73±0.45 -6.44 ＜0.000 1images/BZ_19_1737_824_1741_824.pngVB12(pg/ml) 144.51±28.17 176.33±31.54 -6.20 ＜0.000 1 p53(%) 43.21±4.47 13.16±2.39 48.89 ＜0.000 1

2.2 兩組患者VB9和VB12分布情況比較 見圖1。在VB9和VB12含量均偏低時，病例組患者的分布頻數(shù)顯著高于對照組(t=4.847，P＜0.05)。在VB9和VB12含量均正常時，對照組的分布頻數(shù)明顯高于病例組(P＜0.05)。兩組間低VB9和正常VB12，正常VB9和低VB12的分布頻數(shù)比例相當(dāng)，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

圖1 兩組VB9和VB12分布情況比較

2.3 p53在不同程度VB9和VB12分布中的表達(dá)水平比較 見圖2。在VB9含量偏低且VB12含量正常時，對照組中細(xì)胞p53表達(dá)未染色和輕度染色的比例顯著高于中、重度染色的比例(P＜0.05)。在VB9和VB12含量均偏低時，病例組細(xì)胞p53表達(dá)中、重度染色的比例顯著高于未染色和輕度染色的比例，并且與其余兩組病例組的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.551，P＜0.05)。

圖2 p53在不同程度VB9和VB12分布中的表達(dá)水平比較

2.4 兩組患者同型半胱氨酸的含量和分布情況 見圖3。病例組的同型半胱氨酸含量為43.21μmol/L，且同型半胱氨酸患者分布比例為80%，對照組的同型半胱氨酸含量為13.16μmol/L，且同型半胱氨酸分布比例為20%，兩組間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.226，P＜0.05)。

圖3 比較兩組間同型半胱氨酸的含量和分布情況

2.5 低VB9和VB12的MBA患者同型半胱氨酸含量與p53表達(dá)的相關(guān)性 見圖4。由2.2結(jié)果可知，在VB9和VB12含量均偏低時病例組患者的分布頻數(shù)可達(dá)75%，因此接下來探究在這種類型患者中同型半胱氨酸含量與p53表達(dá)比例的相關(guān)性，結(jié)果顯示兩者之間呈現(xiàn)正相關(guān)性(Y=0.655X+12.42，r=0.661)。

圖4 低VB9和VB12的MBA患者同型半胱氨酸的含量與p53表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

MBA的特征是紅細(xì)胞數(shù)量減少，以及存在體積異常和發(fā)育不良的紅細(xì)胞(巨母細(xì)胞)，其主要是由VB9和VB12的缺乏所致[7]。同型半胱氨酸水平是血漿中低VB9和VB12的指示劑[8]。

本研究探究兩組VB9和VB12的分布情況，結(jié)果顯示在VB9和VB12含量均偏低時，病例組患者的分布頻數(shù)顯著高于對照組(P＜0.05)。在VB9和VB12含量均正常時，對照組的分布頻數(shù)明顯高于病例組(P＜0.05)，這可再次驗證上述說法。

本研究比較p53在不同程度VB9和VB12分布中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示在VB9和VB12含量均偏低時，病例組細(xì)胞p53表達(dá)中、重度染色的比例顯著高于未染色和輕度染色的比例，并且與其余兩組病例組的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，可能存在的作用機(jī)制是：p53作為修復(fù)受損DNA第一線，它是細(xì)胞核DNA的主要保護(hù)因子，保護(hù)細(xì)胞DNA免受各種損傷，它通過觸發(fā)細(xì)胞凋亡來消除受損的細(xì)胞[9-11]。因而可在MBA細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)p53的高表達(dá)，這可能是對低水平VB9和VB12引起的細(xì)胞損傷的一種反饋性應(yīng)答機(jī)制[12-15]。

本研究比較兩組間同型半胱氨酸的含量和分布情況，結(jié)果顯示病例組的同型半胱氨酸含量為43.2μmol/L且同型半胱氨酸患者分布比例為80%，對照組的同型半胱氨酸含量為13.1μmol/L時同型半胱氨酸分布比例為20%，兩組間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

最后，本研究探究低VB9和VB12的MBA患者同型半胱氨酸的含量與p53表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果表明在MBA患者中兩者呈正相關(guān)(Y=0.655X+12.42，r=0.661)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在MBA病例中VB9和VB12低水平,并伴隨同型半胱氨酸和p53的高表達(dá)。因此，測定貧血患者中p53的表達(dá)可能有助于MBA的診斷。但是由于本研究中樣本量較小，實(shí)驗結(jié)果可能存在偏頗，后續(xù)研究仍將繼續(xù)圍繞此類課題更深入、全面的開展。