表皮生長因子受體（EGFR）基因突變檢測質控品制備及應用

蔣玲麗，黃中強，王雪亮，鮑蕓，王青，肖艷群

（上海市臨床檢驗中心，上海 200126）

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占所有肺癌的75%～80%，并且是世界上死亡率最高的癌癥[1]。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因是NSCLC的高頻驅動基因[2]，相關指南推薦所有含腺癌成分的NSCLC常規檢測EGFR[3]，通過檢測EGFR基因突變位點指導NSCLC的治療和判斷預后[4]。開展EGFR基因突變檢測的分子病理實驗室必須按要求進行質量控制，而開展室內質量控制和室間質量評價都需有適宜的質控品，但實際工作過程中收集或制備出合適的質控品是實驗室面臨的一大難題。為了滿足臨床實驗室質量控制的需要，研制了模擬臨床樣本的EGFR基因突變檢測質控品，并評價其臨床適用性。

1 材料和方法

1.1 細胞株 H1650和H1975EGFR突變型細胞系和人肺癌細胞系A549EGFR野生型細胞系購自中國科學院細胞庫，SW48EGFR突變型細胞系購自美國標準生物品收藏中心（American type culture collection，ATCC）。H1650和H1975細胞分別在含有10g/dl FBS的RPMI-1640培養液中，37℃及5ml/dl CO2培養箱內培養，每周傳代2～3次；A549細胞在含有10g/dl FBS的F-12K培養液中，37℃及5ml/dl CO2培養箱內培養，每周傳代2～3次；SW48細胞在含有10g/dl FBS的L-15培養液中，37℃培養箱內培養，每周傳代1～2次。

1.2 儀器與試劑 ABI7500實時熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司），NanoDrop One分光光度計（美國Thermo公司），INC 153 二氧化碳培養箱（德國Memmert公司）。人類EGFR基因突變檢測試劑盒（廈門艾德生物醫藥科技股份有限公司，武漢海吉力生物科技有限公司，武漢友芝友醫療科技有限公司），石蠟組織DNA提取試劑（德國Qiagen公司）。

1.3 方法

1.3.1 質控品制備：所有細胞傳至第10代時去培養基，PBS洗滌2次，離心5min收集細胞。收集的細胞按突變型細胞系和野生型細胞系不同比例混勻后采用4g/dl中性甲醛液固定，加入伊紅點染腫瘤細胞，經乙醇梯度脫水和二甲苯透明后充分浸蠟。制備成含有不同突變的甲醛固定石蠟包埋(formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE)切片。為評價切片中腫瘤細胞的形態、數目及分布狀態，在每個蠟塊最前和最后各切一張4μm的白片進行HE染色，評估腫瘤細胞數量。評估合格的蠟塊，切片后放入1.5ml離心管，每管內放置2張10μm的卷片，切片后按順序排放，每個蠟塊制備80份質控品，室溫保存待用。

1.3.2 質控品性能評價：采用Sanger測序進行EGFR基因突變的驗證，二代測序進行突變等位基因含量的測定。用QIAamp石蠟組織DNA提取試劑盒進行提取，采用分光光度法測定濃度和純度后，用三種不同商品化試劑檢測。采用擴增阻滯突變系統（amplification refractory mutation system，ARMS）評估質控品均勻性和穩定性。從80份樣本中分別抽取第1，40和80份樣本檢測評估均勻性。每月抽取1份（按等距隨機抽樣）質控品評估穩定性。

1.3.3 組織室間質評計劃：將含不同突變類型及不同突變率共5份樣本的樣本盤，隨機編碼后發送至參評實驗室，要求各質評實驗室采用日常方法進行DNA提取和EGFR基因突變檢測，并在2周內將結果上傳至中心數據庫，超過規定時間系統不再接收上傳數據。

1.3.4 質評結果分析：依據回報結果計算各參評實驗室的得分情況。依據回報結果，與預期結果相符計20分，與預期結果不符計0分，≥80分判定為室間質評成績合格。同時計算每個樣本的符合率以及陽性樣本和陰性樣本的總體符合率，并對不符合樣本原因進行匯總分析。

2 結果

2.1 質控品評估結果

2.1.1 測序法驗證結果：見圖1。4個突變樣本經Sanger測序驗證，結果與細胞系預期基因型一致，采用二代測序（next generation sequencing，NGS）測定突變等位基因的含量結果見表1。

圖1 突變型樣本Sanger 測序結果

表1 NGS檢測結果

2.1.2 適用性評價：采用國內臨床常用的三種EGFR基因突變檢測試劑進行檢測。國內商品化試劑不能區分G719A，G719S還是G719C，僅報告為G719X。三種試劑5個樣本檢測結果分別為G719X，T790M/L858R，G719X，19del和野生型，與預期基因型一致。

2.1.3 均勻性和穩定性評價：采用ARMS法評估質控品的均勻性和穩定性。用QIAamp石蠟組織DNA提取試劑盒進行提取，采用分光光度法測定濃度和純度，每次提取濃度均大于30ng/μl，純度A260nm/A280nm均在1.8～2.0之間。分別檢測第1，40和80份質控品，檢測結果一致并符合細胞系預期基因型，表明制備的質控品均勻。質控品室溫放置，每月抽取1份，連續檢測12個月，檢測結果一致并符合細胞系預期基因型，表明制備的質控品穩定。

2.2 室間質量評價反饋結果

2.2.1 實驗室總體回報情況：制備的質控品在2019年9月發放至32家實驗室，在規定時間內收回有效報告28份（上海市24份，外省市4份）。其中20家采用ARMS，4家采用NGS，2家采用實時熒光聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)，1家采用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS），1家采用流式熒光雜交法。28家實驗室中21家使用商品化試劑，涉及11個試劑品牌；7家使用自配試劑。

2.2.2 結果評價與分析：28家實驗室中20家（71.43%）檢測結果完全正確，7家（25%）檢測結果為80分，1家（3.57%）檢測結果小于80分。5個樣本符合率分別為92.86%（26/28），96.43%（27/28），78.57%（22/28），96.43%（27/28）和100%（28/28），突變型樣本和野生型樣本的符合率分別為91.07%（102/112）和100%（28/28）。10個檢測不符合結果全部為突變型樣本檢測錯誤，具體結果見表2。

表2 EGFR室間質評樣本不符合原因分析（n=10）

3 討論

臨床上EGFR基因突變項目檢測步驟多、樣本處理過程復雜、人為影響因素多，相比普通血液樣本的處理，脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取增加了脫蠟的過程，為保證檢測結果的準確可靠，需在檢測過程中使用質控品進行監控。由于質控品來源短缺，目前實驗室大多采用試劑盒提供的陽性標準品作為室內質控，此類標準品通常為人工合成質粒，不參與樣本處理過程，不能監測樣本檢測的全過程，不能稱為嚴格意義上的室內質控，故不能滿足質量管理和質量控制的要求。當前常用的分子病理檢測質控品主要有以下兩種：①天然樣本，即患者組織樣本；②人工制備的質控品，包括質粒DNA或基因組片段、細胞系、異種移植腫瘤組織、基因編輯修飾細胞等[5]。已有多個研究報道[6-7]使用不同類型細胞系作為質控品樣本用于EQA評價中。本研究利用篩選含EGFR不同突變位點和不含EGFR突變位點細胞系，經培養收集、固定、石蠟包埋后切片制備成質控品。制備的質控品在不同的商品化試劑中具有良好的適用性，并且通過均一性和穩定性評價，表明質控品性能良好。本研究結果顯示制備的質控品可長期保存，故可解決質控品來源問題。后期本研究將通過不同比例的突變型細胞系和野生型細胞系混合制備成不同突變比例的質控品以滿足不同靈敏度檢測試劑盒使用需求。

另外利用制備質控品組織室間質量評價，結果表明28家實驗室中只有1家實驗室結果不滿意，通過調查該實驗室為未經PCR實驗室驗收的醫學檢驗實驗室，且使用自建方法（laboratory developed test，LDT）檢測。另外140個檢測結果中10個不符合結果全部為突變型樣本檢測錯誤，包括突變型檢測為野生型及檢出突變但突變結果錯誤。其中5個為3號樣本G719S檢測為野生型結果，該樣本突變比例為23.01%，是4個突變型樣本中突變比例最低的樣本，分析原因可能為一些提取效率及擴增效率較低的實驗室在低突變樣本中出現了漏檢，此種情況需引起實驗室的關注。通過此次調查實驗室應關注以下問題：①實驗室應在進行性能驗證后開展檢測，如使用LDT則需進行充分的方法學確認；②新開展PCR檢測的實驗室需進行PCR實驗室備案，在滿足條件后方可開展PCR檢測工作；③開展PCR檢測的實驗室人員必須經具有資格的培訓單位進行PCR崗前培訓；④實驗室應加強人員培訓，提高DNA提取效率，如有可能采用全自動提取儀以提高提取效率。綜上所述，利用細胞培養制備的EGFR質控品具有較好的均勻性、穩定性和臨床適用性，可用于臨床開展室內質量控制和室間質量評價活動。