基于ITS序列的DNA條形碼技術鑒定紅豆杉屬植物

尹文秀 ，張明哲，樓成杰，王金磚，于文濤，胡美玲，吳 姍，虞惠貞，許 瑾，張曉峰，李明福

（1.浙江省檢驗檢疫科學技術研究院，浙江 杭州 310016；2.南京市產品質量監督檢驗院，江蘇 南京 210000；3.福州海關，福建 福州 350001；4.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176）

紅豆杉屬Taxus植物隸屬于紅豆杉科Taxaceae，為常綠喬木或灌木，是第三紀孑遺植物[1]，含有多種藥用成分[2]。紅豆杉屬植物廣泛分布于歐洲、北美洲及東亞等北半球地區，在全世界有11種，分別為球果紅豆杉T.globosa，短葉紅豆杉T.brevifolia，歐洲紅豆杉T.baccata，加拿大紅豆杉T.canadensis，佛羅里達紅豆杉T.floridana和曼地亞紅豆杉T.×Media[2]。我國有3種2變種，即密葉紅豆杉T.funana，東北紅豆杉T.cuspidata，西藏紅豆杉T.wallichiana，紅豆杉T.wallichianavar.chinensis和南方紅豆杉T.wallichianavar.maire[3-4]，均為《國家重點保護野生植物名錄（第一批）》中的I級重點保護野生植物[5]。

近年來，紅豆杉屬植物的藥用價值得到了廣泛關注和深入研究。1971年，首次從短葉紅豆杉樹皮中提取出的紫杉醇，是迄今為止最成功的抗癌藥物之一[6-7]，然而紅豆杉屬樹種耐蔭性強，在天然林中生長緩慢，分布星散，野生樹木更是日漸減少[8]。紅豆杉物種有限的自然資源限制了紫杉醇的提取[9-10]，供需矛盾日益突出。為更好地加強對紅豆杉屬植物的保護和利用，開展準確鑒定必不可少。DNA條形碼技術（DNA barcoding）是利用標準的一個或多個DNA片段進行物種鑒定及探索其親緣進化關系的方法[11-13]，劉潔等選取了rbcl，matk，trnH-psbA，trnL-F和internal transcribed spacer（ITS）5對引物對歐洲和亞洲的紅豆杉進行鑒別，結果表明trnl-F和ITS這兩對引物可單獨使用或者結合起來對歐洲和亞洲紅豆杉進行鑒別[14]。本研究采用DNA條形碼技術開展對紅豆杉屬植物的準確鑒定，依據劉潔等的實驗結果并結合蔣敏捷等的方法[14-15]，選用ITS1-18S開展紅豆杉屬植物的鑒別，可直接區分南方紅豆杉、東北紅豆杉和歐洲紅豆杉3種紅豆杉屬植物。此研究為口岸快速篩查和鑒定提供了新型的技術方法，方法便捷可靠，同時對促進物種資源的保護和利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

于2017年3月，先后于上海植物園、杭州植物園、南京植物園和浙江省林業科學研究院進行采樣，每棵樹采集一年生新鮮枝條1份。于上海植物園采集南方紅豆杉樣品1份，編號為H1；采集東北紅豆杉樣品1份，編號為D1；采集歐洲紅豆杉樣品1份，編號為EU1。于杭州植物園采集南方紅豆杉樣品1份，編號為H2。于南京植物園采集南方紅豆杉樣品1份，編號為H3，采集歐洲紅豆杉樣品1份，編號為EU2。于浙江省林業科學研究院采集南方紅豆杉樣品1份，編號為H4。于截獲入境東北紅豆杉盆栽采集樣品1份，編號為D2。采集到樣品共計8份。實驗樣品從采集的枝條上隨機選取葉片，清洗干凈進行實驗。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用DNeasy Plant Mini Kit（Qiagen，Hilden，Germany）試劑盒開展DNA提取。樣品前處理需對供試樣品表面進行酒精噴灑消毒，然后將植物葉片在室溫下研磨成粉末狀，后參照試劑盒說明書繼續操作。提取之前按照試劑盒的要求，先將Qiagen試劑盒中的Buffer AP1置于65℃水浴鍋中預熱。

1.2.2 PCR擴增和測序 擴增 ITS1-18S序列正向引物：5’-GCGGTAGGATCATTGTCG-3’，反向引物：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，由TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司合成。PCR擴增體系為試劑20 μL體系[大連寶生物（TaKaRa Ex Taq）提供]，10×Ex Taq Buffer 2.0 μL（Mg2+plus），dNTPs 1.6 μL（2.5 mmol·L-1），引物各0.4 μL（20 μmol·L-1），ddH2O 13.5 μL，Taq酶0.1 μL （5 U·μL-1），DNA模板2 μL（10～ 30 ng·μL-1）。擴增程序：95℃預變性5 min；95℃變性1 min，53℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環；72℃延伸10 min。PCR擴增產物經純化后，送至杭州擎科梓熙生物技術有限公司進行雙向測序。

1.2.3 序列比對和系統發育分析 同一采集地樣品名稱相同的不同株樣品其序列相近[16]，所以每個采集地同一物種采集一個樣品進行序列比對。樣品包括南方紅豆杉4個，H1，H2，H3，H4；東北紅豆杉2個，D1，D2；歐洲紅豆杉2個，EU1，EU2。用DNAMAN（Version 6.0.3.99）軟件對所得序列進行多重比對。同時從GenBank中獲得的與樣品ITS1-18S序列同源性高的序列（見表1），對這些序列進行系統發育樹分析，其中，加入作為外群的紅豆杉科白豆杉屬Pseudotaxus植物白豆杉P.chienii。

采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建ITS1-18S序列的系統進化樹（boostrap1 000次重復）。

表1 從GenBank獲取ITS1-18S序列物種名稱及其登錄號Table 1 The names and the accessions of ITS1-18S sequences of relative species from GenBank

2 結果與分析

2.1 ITS1-18 S序列擴增結果

本文依據劉潔等的實驗結果并結合蔣敏捷等的方法[14-15]合成通用引物ITS1-18S（表1），選取同一采集地的不同樣品H1，D1和EU1進行PCR擴增，擴增長度約為1 100 bp左右，如圖1所示。

2.2 序列比對結果分析

將測序所得樣品的ITS1-18S序列在GenBank數據庫中進行BLAST比對，結果顯示，H1，H2，H3，H4；D1，D2和EU1，EU2樣品的ITS1-18S序列分別與南方紅豆杉、東北紅豆杉、歐洲紅豆杉的ITS1-18S序列的最大匹配率達到99%～ 100%。

將H1，H2，H3，H4；D1，D2和EU1，EU2樣品的ITS1-18S序列與紅豆杉屬3個種的6條序列進行同源序列比對，舍去兩端未對應的序列，共獲得1 009 bp序列信息，其中包括27個變異位點（圖2）；序列比對結果發現，所測未知樣品ITS1-18S序列分別與紅豆杉屬序列相似性最高，達到99%～ 100%，遺傳距離最小，為0.00～ 0.01。可以看出，H1，H2，H3，H4樣品與南方紅豆杉的關系比較近，D1，D2樣品與東北紅豆杉的關系比較近，EU1，EU2樣品與歐洲紅豆杉的關系比較近。

圖1 H1，D1 和EU1 的PCR擴增結果Figure 1 PCR amplification result of sample H,D and EUe EU

2.3 構建系統進化樹

通過DNAMAN軟件，采用鄰接法構建ITS1-18S序列的系統進化樹，經1 000次重復抽樣檢測其置信度。從構建的進化樹（圖3）可以看出，同一物種的紅豆杉屬植物均能聚集在同一分支內，且均獲得較高的支持率（＞90%）。其中，樣品H1，H2，H3，H4與南方紅豆杉ITS1-18S序列聚為一枝，EU1，EU2與歐洲紅豆杉ITS1-18S序列聚為一枝，其bootstrap values分別為99%和95%。D1，D2與東北紅豆杉ITS1-18S序列聚為一枝；白豆杉單獨一枝。

3 結論與討論

將不同采集地的H1，H2，H3，H4樣品，D1，D2樣品和EU1，EU2樣品分別與南方紅豆杉、東北紅豆杉和歐洲紅豆杉3個種的6條序列進行同源序列比對，結果表明，所測樣品的ITS1-18S序列分別與紅豆杉屬的南方紅豆杉、東北紅豆杉和歐洲紅豆杉序列相似性最高，達到99%～ 100%，遺傳距離最小，為0～ 0.01。而且從構建的ITS1-18S序列的系統進化樹也可以看出，H1，H2，H3，H4樣品和南方紅豆杉聚為一枝；D1，D2樣品與東北紅豆杉聚為一枝；EU1，EU2樣品與歐洲紅豆杉聚為一枝；白豆杉單獨一枝。根據以上實驗結果可以判定H1，H2，H3，H4樣品為南方紅豆杉；D1，D2樣品為東北紅豆杉；EU1，EU2樣品為歐洲紅豆杉。實驗結果表明，各樣品的樹種與采集地樣品的信息完全一致，通過ITS1-18S引物可以從分子水平對紅豆杉屬植物進行區分和鑒定，此方法切實可行。

圖2 紅豆杉屬ITS1-18S序列比對結果Figure 2 Sequence alignment of ITS1-18S of Taxus

DNA條形碼技術是傳統鑒定方法的有效補充，此方法不受個體形態、大小等特征和完整性的影響，也就避免了形態學鑒定中存在的局限性，能直接從基因水平上提供豐富的鑒別依據，可有效區分種間差異[11]。張明哲等設計了南方紅豆杉的特異性引物和探針，通過實時熒光PCR方法鑒別南方紅豆杉，但該引物探針僅能鑒定南方紅豆杉和其原始種西藏紅豆杉，而無法對紅豆杉屬其他種進行區分[17]。而本研究基于真核生物的核糖體基因rRNA的內轉錄間隔區（ITS）的高保守性選取ITS序列進行植物物種的分子鑒定，通過DNA條形碼技術可對未知植物樣品進行篩選，可快速將物種范圍鎖定至紅豆杉屬，彌補了南方紅豆杉特異性引物探針局限性的缺陷。我國紅豆杉屬植物大部分位列于瀕危野生動植物種國際貿易公約（CITES）附錄Ⅱ中[18]。所以此法可建立快速、簡便、準確、適合于口岸查驗的鑒定方法，有效保護和利用生物資源。后期可進一步研究探索，在初篩結果上結合紅豆杉屬不同種間的形態學特征進行鑒定或設計紅豆杉屬不同種的特異性引物探針進行實時熒光PCR方法鑒別。

圖3 基于ITS1-18S序列構建紅豆杉科間的系統發育樹Figure 3 Phylogenetic tree of Taxaceae by ITS1-18S sequences