不同銀杏無性系葉片萜內酯含量的差異性研究

何佳林，李瀟雨，李秀紅，季志平

（西北農林科技大學 林學院，陜西 楊凌 712100）

銀杏Ginkgo biloba是古老的孑遺植物，素有“活化石”之稱，現已在全國廣泛栽培，具有極高的研究和開發利用價值。我國擁有世界銀杏資源的70%以上[1-6]，開發利用潛力巨大。銀杏的葉、果、樹皮均可入藥，尤其是葉，藥用價值很高。銀杏葉主要含萜內酯（terpene lactones）類化合物[7-9]，對心腦血管疾病具有較好的療效。

銀杏萜內酯被認為是銀杏葉中關鍵的藥用活性成分，銀杏葉片萜內酯含量是衡量葉片質量優劣的一個極其重要的指標，也是選育優良品種的指標之一[1,4]。本文對陜西寶雞銀杏資源圃引進和篩選的20個銀杏優良無性系葉片萜內酯的含量進行了差異性分析研究，旨在為藥用銀杏品種的選育和開發利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為陜西寶雞銀杏資源圃引進和篩選的20個銀杏優良無性系，見表1。

表1 20個銀杏無性系來源Table 1 Origin of 20 G.biloba clones

1.2 試驗方法

1.2.1 生長指標測定 2016年9月中旬，在資源圃對供試銀杏進行了生長指標測定。

（1）用DQW-2望遠測樹儀測定標準樹樹高，用圍尺測量地徑，并統計樹干主要側枝數及單株產葉數；

（2）每個無性系隨機選取3株樣株，在每株樣株上、中、下部位的不同方位隨機摘取30張完全功能葉片帶回實驗室進行試驗測定（以下每項均測定全部葉片，取平均值）：用游標卡尺測量單葉長、葉寬、葉柄長；用EPSON4990掃描儀（上海迎盛辦公設備有限公司）測量單葉葉面積；用Olympus顯微鏡（上海卓康生物科技有限公司）測量葉厚；用BS210S電子自動天平測定單葉鮮質量及單葉干質量，并計算葉片含水率：

（3）株葉鮮質量采用標準枝調查方法：清點出標準枝上的總葉片數，隨機摘取上、中、下部位不同方位的葉片50片，帶回實驗室稱量，計算葉片平均質量，獲得株葉鮮質量。每株樣株只選擇一枝標準枝，不重復。

1.2.2 銀杏萜內酯含量測定 采用高效液相色譜法[10-12]。試驗所用儀器包括高效液相色譜儀（Waters公司）、510泵、Lambda-Max 481蒸散光檢測器、740數據處理機、色譜柱為Water Nova-Pak C18柱（4.6 mm×20 cm）。檢測的萜內酯主要包括：白果內酯（110865-200404）、銀杏內酯A（110862-200305）、銀杏內酯B（110863-200507）和銀杏內酯C（110864-200304）。對照品均購自中國藥品生物制品檢定所；甲醇、乙腈為色譜純，水為二次蒸餾水，其他試劑均為分析純。

首先將鮮樣葉在80～90℃鼓風烘箱中烘干15～30 min，然后降溫至60～70℃，烘干至恒重，用研缽或帶刀片的磨樣機粉碎，過60目篩裝瓶備用。每個測試材料取干燥粉碎葉片500 mg，用5 mL 10%甲醇水溶液提取15 min，過濾，將濾液按每秒1滴的速度過聚酰胺柱，然后蒸發濾液，殘渣用甲醇溶解，加入少量苯甲醇和水。色譜流動相為水-甲醇-二氫呋喃（7:2:1），流速為1 mL·min-1，檢測波長219 nm，C18柱。

式中，G為峰面積；I.S為內標（苯甲醇）峰面積；M為銀杏葉質量；R為分離度，是相鄰色譜峰保留時間之差與兩色譜峰峰寬均值之比。

1.2.3 數據處理及分析方法 采用SPSS16.0統計分析軟件進行數據處理。對試驗數據進行方差分析、相關性分析、逐步回歸分析后找出影響銀杏萜內酯含量的相關規律并建立回歸模型。從各生長指標間單因素相關性分析結果中剔除5個相關性較弱的因子（側株數、葉基角、株葉數、葉柄長、地徑），對20個品種的10個指標進行主成分分析（Principal Components）。分別采用不旋轉法（None）、方差最大法（Varimax）、四次方最大法（Quartimax）、等量最大法（Equamax）和斜交旋轉法（Promax），計算出相關系數矩陣及其特征值、各主成分的貢獻率和累積貢獻率，以累積貢獻率大于85%的原則選擇主成分。在主成分分析的基礎上，通過聚類分析法選擇具有優良品性的葉用銀杏無性系。

采用主成分分析方法，將累計貢獻率>85%的各個主成份的權重系數分別乘以各指標原始數據后求其與萜內酯含量之間相關性。

2 結果與分析

2.1 銀杏葉總萜內酯含量與生長指標相關性分析

對20個銀杏無性系的生長指標和葉總萜內酯含量進行了測定，將主要性狀測定結果的平均值列于表2，并統計分析各性狀指標的標準偏差。

表2 20個銀杏無性系的平均生長指標和葉總萜內酯含量Table 2 Average growth traits and total terpene lactones of 20 tested clones

從表2可以看出，僅按葉總萜內酯的含量比較，以陜引6號、馬鈴3號的葉總萜內酯含量最高。進一步分差分析（表3）表明，銀杏葉總萜內酯含量與葉寬、葉柄長和葉厚呈弱線性正相關關系；與樹高、葉長、葉面積、葉鮮質量、葉干質量呈強線性正相關關系，其中與樹高、葉長、葉干質量之間達到極顯著相關（P＜0.01），其相關系數分別為0.695，0.565，0.640；與地徑呈弱線性負相關關系；與葉含水率呈強線性負相關關系，其相關系數為-0.480。根據以上結果，說明樹高、葉長、葉面積、葉鮮質量、葉干質量越大且葉含水率越低的銀杏無性系，其葉總萜內酯含量越大。

表3 葉總萜內酯含量與銀杏各生長指標間相關性分析Table 3 Correlation analysis on total terpene lactone with growth traits

由表3可以看出，銀杏葉總萜內酯含量分別與樹體指標中的樹高，葉形指標中的葉長、葉面積，葉質量指標中的葉鮮質量、葉干質量、葉含水率存在顯著或極顯著相關關系，但與葉形指標中的葉寬、葉柄長和葉厚相關性較弱。根據以上結果，說明樹體指標和葉形指標中各指標對銀杏葉總萜內酯含量的影響并不一致，所以，只能確定葉片質量指標對銀杏總萜內酯含量有顯著影響。

2.2 主成分分析

葉萜內酯含量高的無性系，其株葉萜內酯總量不一定高，因為影響銀杏株葉萜內酯總量的指標很多，它們間相互關聯而且所反映的側重點各不相同，因此，需要從諸多性狀指標中篩選幾個新的綜合變量，而又不丟失原來多個性狀指標所提供的主要信息，從而簡化數據結構，降低分析難度。主成分分析無疑提供了極佳的手段。

2.2.1 特征值和特征向量 主成分的特征值和貢獻率是選擇主成分的依據。表4把原有10個原性狀指標轉化為10個主成分的詳細信息。從表4中可以看出，第1個主成分的特征值為5.6，方差貢獻率為55.6%，代表了全部性狀55.6%的信息，是最主要的主成分。

表4 主成分的特征值、貢獻率和累積貢獻Table 4 Eigenvalue and contribution rate and cumulative contribution rate of principal components

第2個主成分的特征值為2.4，方差貢獻率為23.6%。第3個主成分的特征值為1.1，方差貢獻率為10.6%。其他主成分的貢獻率依次明顯減少。前3個主成分的累計貢獻率達到89.9%（>85%），表明前3個主成分已經代表了全部因子89.9%的綜合信息，其余成分所起的作用很小。從圖1可看出，3個主成分在空間分布范圍內呈現明顯的差異。因此，選取前3個主成分作為影響株葉內酯總量的重要主成分，分別用F1，F2，F3表示。

2.2.2 各主成分與株葉萜內酯總量的相關性分析

圖1 3個主成分空間分布圖Figure 1 Spatial distribution of 3 principal components

根據主成分各載荷因子所占權重命名各主成分（表5）：第一主成分為葉綜合因子；第二主成分為葉產量因子；第三主成分為葉質量因子。上述3個主成份累計方差貢獻率達到89.886%，可以很好地反映原指標所包含的絕大部分信息，這說明該3個主成分是表征萜內酯總量的關鍵因子，具有較強的綜合代表性、分析的可靠性和穩定性。

將3個主成分的各權重系數分別乘以各指標原始數據后求其與株葉萜內酯總量間的相關性。從計算結果可以看出，3個主成分均與株葉萜內酯總量相關性較高（表6）。說明第一主成分中占較大載荷因子的是葉鮮質量、葉面積、葉長和葉干質量，第二主成分中占較大載荷因子的是株葉數、株葉鮮質量、株葉干質量和樹高，第三主成分中占較大載荷因子的是葉含水率和葉厚。進一步證實上述10個生長指標就是影響銀杏萜內酯的主要指標。

2.3 聚類分析

應用統計分析軟件DPS軟件包中提供的聚類分析應用程序，采用歐氏連接距離法對這20個供試材料進行Q型聚類分析。為了消除指標間數量級差異對聚類分析結果的影響，對原始數據采用極大值標準化法處理再進行聚類分析，計算歐氏距離使用的統計量取用主成分分析中的轉換數據。聚類結果如圖2所示。由圖2可知，在歐氏連接距離λ=431.25時，根據生長指標和株葉萜內酯總量把20個銀杏無性系分為性狀差異明顯的5個大類，第Ⅰ類：C94-16，C95-09和C94-56；第Ⅱ類：C95-07，C95-11和陜引19；第Ⅲ類：C94-68，C95-08；第Ⅳ類：C95-17，陜引17號，馬嶺3號，陜引10號，陜引16號，陜引21號，陜引23號和陜引26號；第Ⅴ類：陜引6號，陜引9號，陜引11號和陜引12號。

表5 因子載荷矩陣Table 5 Factor loading matrix

表6 主成分與株葉萜內酯總量相關性分析Table 6 Correlation analysis on principal components and total terpene lactones

對聚類分析所得的5類銀杏無性系主要生長指標及株葉萜內酯總量進行比較分析，結果見表7。從表7中可以看出，第Ⅰ、第Ⅱ類無性系的葉含水率、株葉數、株葉鮮質量和株葉干質量較第Ⅲ、第Ⅳ、第Ⅴ類有明顯的優勢，而這些指標恰恰是影響株葉萜內酯總量最主要的因素。單從葉萜內酯的含量看，陜引6號、馬鈴3號的葉萜內酯含量最高，但產葉量都極低，株葉萜內酯總量小，所以未能歸入第Ⅰ類和第Ⅱ類。雖然第Ⅲ類的葉長、葉面積、葉鮮質量、葉干質量均大于第Ⅱ類，但影響株葉萜內酯總量的指標株葉數、株葉鮮質量、株葉干質量卻低于第Ⅱ類，因此，若以藥用成分銀杏萜內酯總產量為目的選擇栽培無性系，則適宜在第Ⅰ、第Ⅱ類中選擇優勢材料。綜合以上分析結果得出，C94-16，C95-09和C94-56可以作為藥用銀杏的優選材料。

圖2 銀杏無性系萜內酯總量聚類分析Figure 2 Cluster analysis on total terpene lactones in 20 clones

表7 聚類分析結果主要性狀對比Table 7 Cluster analysis on main traits

3 結論與討論

（1）銀杏葉萜內酯含量與其生長指標間存在一定的相關性，銀杏葉萜內酯含量與葉寬、葉柄長和葉厚呈弱線性正相關關系；與樹高、葉長、葉面積、葉鮮質量、葉干質量呈強線性正相關關系，其中與樹高、葉長、葉干質量達到極顯著相關關系，而與葉含水率呈強線性負相關關系。但是，銀杏葉萜內酯的含量不是受單一因素的調控，而是受到包括光照、溫度、土壤濕度等綜合條件影響，光照等環境因素又與植物自身的生理調節存在著密切的聯系[13]。也就是說，銀杏葉萜內酯受多個環境因素的綜合調控，外部環境不僅影響銀杏的生長發育，而且通過對銀杏的生理調節作用來影響銀杏葉萜內酯含量。

（2）主成分分析表明，占較大載荷因子的葉質量、葉面積、葉長、樹高和葉含水率是影響銀杏萜內酯含量的主要因子。

（3）聚類分析結果表明，C94-16，C95-09和C94-56三個銀杏無性系的生長性狀、葉總萜內酯含量及株葉萜內酯總量方面比其他無性系具有綜合優勢，因此，可以從這三個優系中選育最適合以藥用成分銀杏萜內酯為目標的銀杏栽培優良無性系。

（4）本研究只針對20個銀杏無性系葉萜內酯含量的差異性進行了研究，而對引起這些差異的內在機理尚不明確，有待于今后進一步深化研究。