早期結直腸癌組織中PGC-1α、NF-κB p65的表達及與臨床病理特征和預后的相關性分析

楊亞玲，周 寧，黃 丹

結直腸癌是發生于結腸與直腸的常見惡性腫瘤，目前認為主要是環境因素與遺傳因素綜合作用的結果[1]。由于該疾病早期無明顯癥狀，一旦確診，患者往往處于疾病的中晚期，故結直腸癌的早期診斷對患者的治療及預后具有重要意義[2]。過氧化物酶體增殖物受體共激活因子-1α(peroxisome proliferator ivated receptor γ coactivator-1α， PGC-1α)是一種能與多種轉錄因子發生反應的多功能核轉錄因子，該因子與腫瘤的發生與發展具有緊密聯系[3]。而核因子-κB(nuclear factor-κB， NF-κB)p65則被證實在腫瘤組織中參與細胞增殖等多個步驟[4]。本研究分析結直腸癌患者PGC-1α和NF-κB p65的表達及與臨床病理特征和預后的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取我院2015年11月—2017年11月收治的75例結直腸癌患者作為研究對象，均經手術或穿刺活檢證實。男42例，女33例，年齡25～76(59.31±8.65)歲。納入標準：術前未接受化療、放療等抗癌輔助治療；本研究經醫院醫學倫理委員會審核通過，臨床資料均完整；無其他惡性疾病；患者均簽署知情同意書。排除標準：合并肝、腎、心臟等臟器嚴重疾病者；妊娠期或哺乳期婦女；合并嚴重神經功能、認知功能障礙者；嚴重高血壓、糖尿病、冠心病者；有藥物過敏史者。

1.2儀器與試劑 10%甲醛溶液、石蠟、Trazol溶液(日本Takara公司)、PCR儀(美國ABI-7500 Real-Time PCR)、磷酸鹽緩沖液(PBS，北京賽默飛世爾生物化學制品有限公司)、免疫組化二抗試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)、兔抗人NF-κB p65多克隆抗體(英國Abcam公司)、PGC-1α抗體(英國Abcam公司)。

1.3檢測方法

1.3.1PGC-1α表達檢測：由相關專業操作人員用Trazol溶液將黏膜組織樣本的總RNA進行提取，并嚴格按照試劑盒說明合成cRNA。合成完畢后取2組cDNA 5 μl，將其作為模板，再分別加入至2 μl 10×buffer和4 μl H2O中，并經過高溫變性、循環，再進行PCR儀檢測。將PCR產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，參考DL2000 marker分子質量標準進行紫外凝膠掃描成像，該樣本的表達相對強度則為與樣本內對照β-actin的熒光強度比值。

1.3.2NF-κB p65表達檢測：取受檢者黏膜組織，在30 min內將黏膜組織置于10%甲醛溶液中固定浸泡，予以石蠟包埋切片、二甲苯脫蠟、梯度乙醇予以脫水，并使用枸櫞酸鹽修復液對組織進行3 min的高壓修復，修復完成后用免疫組化筆在受檢組織1～2 mm外劃圈，再加入3% H2O2放置于恒溫箱中孵育20 min，以阻斷內源性過氧化物酶干擾，并運用磷酸鹽緩沖液漂洗，漂洗3次后加入適量的10%正常羊血清于室溫下密閉15 min，棄血清，并以1∶500的稀釋比例滴加兔抗人NF-κB p65多克隆抗體放置于4℃的恒溫箱中過夜，再用PBS漂洗3次，并予以DAB顯色、蘇木素復染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。各組標本均將PBS代替一抗作為陰性對照，以自身對照作為陽性對照。

1.4結果判定 PGC-1α、NF-κB p65免疫組化結果判定[5]：由兩位病理科醫生在400倍光鏡下隨機選取10個視野對染色細胞數量和染色程度評分，陽性細胞數量<1%為0分，1%～10%為1分，11%～50%為2分，>50%為3分；染色程度:無染色為0分，弱陽性顯黃色為1分，中等陽性顯淺棕色為2分，強陽性顯棕褐色為3分。將二者所得分數合計：無表達或低表達為0～3分，高表達為4～6分。

2 結果

2.1PGC-1α與NF-κB p65在不同組織中的表達 PGC-1α與NF-κB p65在癌組織中高表達率均高于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 PGC-1α與NF-κB p65在結直腸癌癌組織和癌旁組織中的表達情況[例(%)]

2.2PGC-1α表達與結直腸癌癌組織臨床病理特征的關系 PGC-1α在結直腸癌中的高表達率與腫瘤分化程度呈反比(P<0.01)；TNMⅠ～Ⅱ期、淋巴結無轉移且(或)無血管侵犯的結直腸癌患者PGC-1α表達率明顯低于Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結有轉移、血管受侵犯的患者(P<0.01)；而患者年齡、性別、腫瘤大小與PGC-1α表達無明顯相關性(P>0.05)。見表2。

表2 PGC-1α水平與結直腸癌臨床病理特征關系(例)

2.3NF-κB p65表達與結直腸癌癌組織臨床病理特征的關系 結直腸癌癌組織中NF-κB p65的表達與患者性別、年齡、腫瘤大小無關(P>0.05)；TNM分期處于Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移者、有血管侵犯、腫瘤分化程度低的患者NF-κB p65的表達明顯高于TNMⅠ～Ⅱ期、腫瘤分化程度高、無淋巴結轉移、無血管侵犯患者(P<0.01)。見表3。

表3 NF-κB p65與結直腸癌臨床病理特征關系(例)

2.4PGC-1α與NF-κB p65表達與結直腸癌病理特征的相關性分析 經Spearman相關進行分析，結直腸癌患者PGC-1α與NF-κB p65的表達水平與腫瘤分化程度呈負相關，與TNM分期、血管侵犯程度、淋巴結轉移呈正相關(P<0.01)。見表4。

表4 PGC-1α與NF-κB p65與結直腸癌病理特征的相關性

2.5預后情況 隨訪2年后，75例結直腸癌患者2年總生存率為73.33%(55/75)。PGC-1α高表達和低表達的2年總生存率分別為74.14%(43/58)、70.59%(12/17)，不同表達水平生存率比較差異無統計學意義(P>0.05)；NF-κB p65高表達和低表達的2年總生存率分別為73.08%(38/52)、73.91%(17/23)，不同表達水平生存率比較差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討論

結直腸癌是發生于結、直腸及肛管黏膜上皮的惡性腫瘤，患者預后較差，病死率較高，對人類的健康造成嚴重威脅[6]。近20多年來，世界上多數國家結直腸癌的發病率呈上升趨勢，而我國的發病率上升趨勢也十分明顯[7]。而關于早期診斷、治療以及相關分子生物學研究一直是臨床研究的熱點，有大量文獻指出，結直腸癌的發生、發展與細胞增殖、分化失控及凋亡障礙等因素密切相關[8]。

PGC-1α是一種通過與多種轉錄因子結合并對其基因的轉錄、轉錄后的剪接修飾予以調控的核轉錄因子[9]。近年來有大量文獻已經證明PGC-1α與多種腫瘤的發生、發展具有相關性，PGC-1α的表達在前列腺癌、胃癌中均呈高水平狀態，該因子還可誘導乙型肝炎病毒發生復制、轉錄，進而導致肝癌的發生，對癌癥的發展具有促進作用[10-11]。而也有相關實驗研究表明，PGC-1α可誘導雌激素相關受體，從而使前列腺癌的轉移受到抑制；在乳腺癌癌細胞不斷增殖時，PGC-1α可通過miRNA的作用減少癌細胞的增殖[12-13]，提示PGC-1α不僅是一種促癌因子，通過相關信號因子與癌基因的調控還可成為一種抑癌因子，該結論對惡性腫瘤靶向治療的研究提供了方向[14-15]。

NF-κB是一種多向性轉錄調節因子，包括p65和p50兩種亞型，對多種細胞因子、黏附因子以及生長因子的表達具有調控作用，與炎癥的發生也存在關聯。有相關研究證明，NF-κB在腫瘤組織中表達過量將加速腫瘤的發展，而NF-κB p65在細胞中主要參與基因轉錄的調節[16-17]。有相關動物實驗證實，NF-κB p65在正常組織、炎性組織及癌組織中的表達呈上升趨勢，其基因敲除將導致小鼠的死亡[18]。本研究結果顯示，NF-κB p65、PGC-1α在結直腸癌患者癌組織中的表達率顯著高于癌旁組織，這有效驗證了上述研究結果，也在一定程度證明了NF-κB p65、PGC-1α表達在結直腸癌的發病過程中發揮了不可或缺的作用，有可能隨著病情的發展其表達水平逐漸升高。

本研究還發現，NF-κB p65、PGC-1α的表達與患者年齡及腫瘤大小無相關性，而與結直腸癌的TNM分期、淋巴結轉移及血管侵犯程度呈正相關，與腫瘤分化程度呈負相關，提示NF-κB p65、PGC-1α參與了結直腸癌病變過程，在一定程度可能對腫瘤細胞及相關因子的分泌和增殖產生了促進作用，這與吳安定等[19]研究結果一致。

通過我們對手術后患者2年的隨訪，分析NF-κB p65及PGC-1α表達與患者生存率的關系，結果顯示二者表達的差異對結直腸癌患者術后生存情況無影響，而王婷婷等[20]研究結果顯示，PGC-1α的表達與患者病情發展呈一致性，本研究與其存在一定的差異性，考慮為本研究病例數及隨訪時間有限所致，具體情況還需進一步予以討論研究。

綜上所述，NF-κB p65與PGC-1α表達在結直腸癌的發生、發展及血管侵犯等過程中發揮著重要作用，臨床可根據NF-κB p65與PGC-1α表達情況對患者病情進行診斷與治療指導。