超聲波輔助生物酶提取紫薯色素工藝優(yōu)化

東子珺 徐曉萍

摘? ? 要：紫薯色素原料易得、造價(jià)低廉且具有抗癌、抗氧化和預(yù)防疾病等功效，因此紫薯色素提取成為科研者的重點(diǎn)研究對(duì)象。本文通過結(jié)合目前常見的超聲波提取法、生物酶提取法，進(jìn)一步優(yōu)化紫薯色素提取工藝。通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)得到在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)最佳提取工藝為：采用超聲波-半纖維素生物酶協(xié)同提取紫薯色素效果佳，其中酶用量25 U·mL-1、超聲時(shí)間20 min、溫度60 ℃、溶液pH值為4.0、料液比1∶25，得到色素提取量為31.72 mg·（100 g）-1;影響色素提取因素大小為：pH值>酶用量>超聲時(shí)間。本文為紫薯色素的實(shí)際生產(chǎn)和開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：紫薯色素;超聲波;半纖維素酶;提取

Abstract： The raw material of purple potato pigment is easy to be obtained. It has inexpensive price and many effects， such as anti-cancer， anti-oxidation and prevention of disease. Therefore， the extraction of purple potato pigment has become the focus of research. In this paper， the extraction process of purple sweet potato pigment was further optimized by combining the ultrasonic extraction method and biological enzyme extraction method. According to single factor test and orthogonal test， the optimal extraction process within the experimental range was as follows： the ultrasonic and hemicellulose enzyme were used to extract the pigment of purple sweet potato with the best effect. The enzyme dosage was 25 U·mL-1， the ultrasonic time was 20 minutes， the temperature was 60 ℃， the pH was 4.0， the solid-liquid ratio was 1∶25， and the extraction amount of pigment was 31.72 mg·（100 g）-1. The order of the factors affecting the extraction of purple potato pigment was： pH > enzyme dosage > ultrasonic time. It provided some theoretical basis for the actual production， development and utilization of purple sweet potato pigment.

Key words： purple potato pigment; ultrasonic; hemicellulose; extraction

紫薯色素主要成分為花青素。花青素具有抗氧化、抗癌、預(yù)防疾病[1]等功效，常作為食品調(diào)色原料，是人類飲食的重要組成部分[2]。自然界中鮮有單純的花青素存在，在紫薯色素中的花青素主要為矢車菊素、芍藥色素和極少量的天竺葵色素，都是以糖苷化后的酰基化衍生物的形式存在[3]，因此，紫薯色素穩(wěn)定性強(qiáng)[4]，抗氧化效果好[5]。

色素提取常見方法有溶劑萃取法[6]、超聲波提取法[7]、生物酶提取法[8]等。其中溶劑萃取法操作簡便，但提取率低、溶劑使用量大[9]。超聲波提取法利用振動(dòng)和空化效應(yīng)[10]來破壞細(xì)胞，具有提取時(shí)間短、操作簡單、提取率高等特點(diǎn)[11]。生物酶提取法是通過對(duì)植物細(xì)胞相關(guān)物質(zhì)進(jìn)行降解從而提取出色素，具有高效性、專一性[12]，但成本較高。

綜上所述，結(jié)合各個(gè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)，本文將采用超聲波-生物酶協(xié)同提取法，并以檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液作為提取劑，研究紫薯色素的最佳提取工藝，為紫薯色素提取提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

紫薯（購于市場(chǎng)）;檸檬酸（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司 分析純）;檸檬酸鈉（天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠 分析純）;半纖維素酶（源葉生物 20 000 U·g-1）;α-淀粉酶（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司 ≥3 700 U·g-1）;纖維素酶（麥克林 10 000 U·g-1）;檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液（pH值3.2，4.0，4.8）;酶液（5 U·mL）。

1.2 儀器與設(shè)備

遠(yuǎn)紅外干燥箱（220 V，50 Hz，1.2 kW）? ?天津市天宇實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;HD-600超聲儀（220 V/50 Hz，600 W，40 kHz）? ?濟(jì)寧亨達(dá)超聲設(shè)備有限公司;JW-3021HR高速冷凍離心機(jī)? ?安徽嘉文儀器裝備設(shè)備有限公司;722S可見分光光度計(jì)? ?上海菁華科技儀器設(shè)備有限公司;恒溫水浴鍋? ?北京中興偉業(yè)儀器有限公司;多功能粉碎機(jī)? ?佛山德瑪仕網(wǎng)絡(luò)科技有限公司;FA1204B電子天平? ?上海精密科學(xué)儀器;TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)? ?北京普析通用有限責(zé)任公司;FTIR-650傅立葉變換紅外光譜儀? ?天津港東科技發(fā)展股份有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 紫薯粉的制備 紫薯粉的制備工藝：選擇無病變或無腐爛的新鮮紫薯，洗去表面的沉積物，將其（生紫薯或熟紫薯）放入遠(yuǎn)紅外干燥箱中在不同溫度下進(jìn)行干燥，取出后用粉碎機(jī)粉碎，過篩，避光保存。

1.3.2 色素提取流程 本文主要通過超聲波-生物酶協(xié)同提取法對(duì)紫薯色素進(jìn)行提取，并與超聲法和酶解法進(jìn)行對(duì)比。同時(shí)，在文獻(xiàn)[13]中發(fā)現(xiàn)酶解溫度曲線較為平緩，由此推斷酶解溫度對(duì)紫薯色素提取的影響不大，因此本文選用酶解溫度為50 ℃[13]。

超聲波-生物酶協(xié)同提取法操作過程為：用分析天平精確稱取紫薯粉置于大試管中;加入檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液、酶，密封后水浴加熱，再進(jìn)行超聲、離心，取上清液定容至50 mL容量瓶中，并測(cè)定吸光度。

酶解法無需超聲，其余流程同超聲波-生物酶協(xié)同提取法。

超聲法無需酶解，其余流程同超聲波-生物酶協(xié)同提取法。

1.3.3 紫薯總色素含量計(jì)算方法 總色素含量參照文獻(xiàn)[14]提供的公式進(jìn)行計(jì)算。

式中：M—總色素含量/（mg·（100 g）-1），A—吸光度，N—稀釋倍數(shù)，X—浸提液體積/mL，m—原料質(zhì)量/g，98.2—消光系數(shù)。

1.3.4 紫薯中花青素的初步判斷 為確保所提取色素為花青素，本文采用紫外-可見分光光度法[15]和紅外光譜法[16]對(duì)色素進(jìn)行初步判斷。

1.3.5 最大吸收波長測(cè)定 稱取3種紫薯粉各1.000 0 g置于大試管中;加入pH值4.8檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液20 mL，將其密封之后置于50 ℃水浴鍋中水浴1 h，取出放至室溫;轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，以3 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心15 min;取上清液，用pH值4.8檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液定容至50 mL的容量瓶中;通過紫外-可見分光光度計(jì)全波掃描，確定最大吸收波長。

1.3.6 單因素試驗(yàn) 按照1.3.2超聲波-生物酶協(xié)同提取法提取流程以及設(shè)計(jì)的單因素試驗(yàn)條件展開試驗(yàn)（表1）。研究一種因素的影響時(shí)，其余各因素均恒定，并且均采用上一試驗(yàn)的最佳值開展下一項(xiàng)試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫薯粉的選擇

通過圖1可見，生紫薯直接置于烘干箱烘干，紫薯粉末會(huì)發(fā)生褐變現(xiàn)象，且隨著溫度升高，褐變現(xiàn)象明顯。這是由于生紫薯粉中淀粉難溶于水，隨著溫度的升高，淀粉分子發(fā)生劇烈振動(dòng)，造成氫鍵斷裂，發(fā)生糊化，產(chǎn)生不同程度的褐變反應(yīng);而熟紫薯由于在蒸熟過程中改變紫薯細(xì)胞膜的通透性，同時(shí)使花青素的多酚含量增加[17]，發(fā)生輔色效應(yīng)，提高花青素的穩(wěn)定性[18]。因此，即使在70 ℃溫度條件下也不會(huì)出現(xiàn)褐變現(xiàn)象。此外，據(jù)研究表明花青素于120 ℃時(shí)降解率最高[19]。綜合考慮，選用熟紫薯粉進(jìn)行研究。

2.2 紫薯中花青素的初步判斷

2.2.1 紫外-可見分光光度法對(duì)紫薯色素的初步判斷 通過將定容后的紫薯色素溶液置于紫外-可見分光光度計(jì)中進(jìn)行掃描，并與花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液的紫外-可見吸收光譜[15]進(jìn)行對(duì)比，初步判斷提取的紫薯色素是花青素。由圖2可知，提取出的色素稀溶液在可見光區(qū)540 nm附近和紫外光區(qū)297 nm、324 nm附近有吸收峰，并且紫薯色素主要在紫外光區(qū)有強(qiáng)吸收，說明紫薯色素存在共軛體系。但紫外主要是針對(duì)無顏色的稀溶液，而提取出的色素是有顏色的濃溶液，因此不適合在紫外進(jìn)行評(píng)測(cè)。通過對(duì)提取出的濃色素溶液在可見光區(qū)進(jìn)行掃描，測(cè)定最大吸收波長為540 nm（圖3）。與文獻(xiàn)[15]中標(biāo)準(zhǔn)溶液紫外-可見吸收光譜圖進(jìn)行對(duì)比，所提取的色素與標(biāo)準(zhǔn)溶液的紫外-可見吸收光譜圖[15]吸收峰位置大致一致。周培劍[20]在對(duì)紫薯色素的提取研究中得出在可見光最大吸收波長為530 nm，與本試驗(yàn)結(jié)果相近，初步判斷提取出的色素為花青素。此外，由于在紫外光區(qū)324 nm附近有吸收峰，可以判斷提取出的花青素存在酰基化[21]，具有更高的穩(wěn)定性[22]。因此，從紫薯中提取出的花青素更有適用性。

2.2.2 紅外光譜法對(duì)紫薯色素的初步判斷 將提取的紫薯色素溶液在紅外光譜儀中進(jìn)行掃描，如圖4所示，并與郭燕等[16]所得標(biāo)準(zhǔn)溶液紅外光譜圖進(jìn)行對(duì)比。通過圖4與標(biāo)準(zhǔn)溶液紅外光譜圖[16]的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)提取出的花青素與標(biāo)準(zhǔn)溶液的紅外光譜圖[16]出峰位置相似。在3 500～3 200 cm-1附近的吸收峰是-OH;在1 650.77 cm-1處的吸收峰是酰基化產(chǎn)物C=O;在1 417.42 cm-1處的吸收峰是苯環(huán)和雜環(huán)上C-C;在1 274.72 cm-1和1 089.58 cm-1處的吸收峰是甲氧基。這些吸收峰表現(xiàn)出酰基化花青素中官能團(tuán)的特征。這一結(jié)論與佀俊茹等[23]在研究中的結(jié)論相似。因此，初步推斷提取出的色素為花青素。

2.3 單因素試驗(yàn)分析

2.3.1 超聲溫度對(duì)紫薯色素的影響 由圖5看出在30 ℃到60 ℃時(shí)，吸光度值隨超聲溫度的升高而增大;在60 ℃之后出現(xiàn)下降趨勢(shì)，這是因?yàn)樵?0 ℃到60 ℃時(shí)，超聲溫度對(duì)紫薯細(xì)胞破壞力增強(qiáng)，使色素流出;而當(dāng)溫度上升到一定值時(shí)，由于天然色素的熱不穩(wěn)定性[24]，使色素提取率降低。彭常安等[25]在研究中表明紫薯色素耐溫在60 ℃及以下。如繼續(xù)升溫會(huì)破壞色素，降低色素的穩(wěn)定性[26]，從而降低色素提取率。因此，判斷最佳超聲溫度為60 ℃。

2.3.2 超聲時(shí)間對(duì)紫薯色素提取的影響 由圖6可看出在10～15 min時(shí)沒有明顯變化;在15～20 min時(shí)吸光度值變大;20 min之后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這是因?yàn)樵?0～15 min時(shí)對(duì)于紫薯細(xì)胞的穿透能力不是很大，使色素流出量較小;而20 min之后隨著時(shí)間增加，色素加熱時(shí)間也隨之增加，破壞色素而導(dǎo)致。關(guān)晴月和鄒宇[27]在研究中得出超聲最佳時(shí)間為20 min，與本試驗(yàn)結(jié)果大致一致，因此初步判斷最佳超聲時(shí)間為20 min。

2.3.3 酶的種類對(duì)紫薯色素提取的影響 由于目前還未有人使用半纖維素酶對(duì)紫薯色素提取展開過研究，只有陳合等[28]使用半纖維素酶對(duì)姜黃素進(jìn)行提取，并得到較好的結(jié)果。由此提出設(shè)想：使用半纖維素酶提取紫薯色素會(huì)提高提取率。為驗(yàn)證該設(shè)想，選取半纖維素酶、纖維素酶和α-淀粉酶分別對(duì)紫薯色素進(jìn)行提取。

如圖7可知，半纖維素酶提取紫薯色素為最佳，因?yàn)榘肜w維素酶提取所得的色素含量要高于纖維素酶和α-淀粉酶，因而選用半纖維素酶進(jìn)行色素提取。

2.3.4 料液比對(duì)紫薯色素提取的影響 由圖8可知，隨著檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液量的增加，吸光度呈現(xiàn)出先平緩，再增長，后下降的趨勢(shì)。這是因?yàn)槿绻崛┑牧坎粔颍瑹o法使提取劑完全滲入紫薯細(xì)胞溶解色素，不足以使色素從細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散出來;之后隨著提取劑量的增加，滲入紫薯粉中的提取劑增多，形成內(nèi)高外低的滲透壓，使色素逐漸被溶解;當(dāng)提取劑過量，稀釋了酶的濃度，使提取率降低。趙二勞等[29]在對(duì)紫薯色素提取工藝研究中得出最佳料液比為1∶25，與本試驗(yàn)結(jié)果一致，因此最佳料液比初步認(rèn)定為1∶25。

2.3.5 酶用量對(duì)紫薯色素提取的影響 由圖9可知，在5～25 U·mL-1隨著酶濃度的增加，吸光度呈現(xiàn)出先增長，后下降的趨勢(shì)。隨著酶濃度的增加，紫薯細(xì)胞內(nèi)半纖維素的降解速率加快，從而加大細(xì)胞內(nèi)色素的滲透率;當(dāng)酶分子被底物飽和后，增加酶量將不會(huì)增大紫薯色素的提取率。姚剛[30]在研究中表明最適酶量為20 U·g-1，與本試驗(yàn)結(jié)果相近。同時(shí)考慮到經(jīng)濟(jì)成本，初步確定酶用量為25 U·mL-1。

2.3.6 pH值對(duì)紫薯色素提取的影響 由圖10可知，紫薯色素提取適合在酸性條件下進(jìn)行。從圖11中看出不同pH值下的顏色不同，主要由于不同的pH值導(dǎo)致紫薯色素的分子構(gòu)型不同[31]，從而發(fā)生了顏色改變。初步確定最佳pH值為3.2。

2.3.7 酶解時(shí)間對(duì)紫薯色素提取的影響 由圖12可知，在15～30 min隨著時(shí)間的增加，紫薯細(xì)胞降解會(huì)隨之增加;在30～45 min變化不大;在45～60 min出現(xiàn)大幅下降，是因?yàn)殚L時(shí)間加熱破壞了酶的活性所致。李輝等[32]在研究中得出最佳酶解時(shí)間為45 min，與本試驗(yàn)結(jié)果相近，經(jīng)綜合考慮，選用最佳酶解時(shí)間為30 min。

2.4 正交試驗(yàn)

為使試驗(yàn)結(jié)果更加精準(zhǔn)，提高紫薯色素的產(chǎn)率，設(shè)計(jì)出三因素兩水平L4（23）的正交試驗(yàn)如表2、表3所示。

由表3中R值（極差）大小可推斷出對(duì)紫薯色素提取時(shí)各因素的影響程度順序?yàn)椋簆H值>酶用量>超聲時(shí)間。通過k值（平均值）的計(jì)算和比較，得到最佳工藝為：超聲時(shí)間20 min，酶用量25 U·mL-1，pH值為4.0，色素提取量為31.72 mg·（100 g）-1。

分別用超聲波-生物酶協(xié)同法、酶解法和超聲法在最佳工藝下進(jìn)行紫薯色素提取，得到吸光度值分別為0.623，0.491，0.572。通過計(jì)算色素提取量分別為31.72，25.00，29.12 mg·（100 g）-1。由此可判斷出對(duì)于紫薯色素提取采用超聲波-生物酶法為最佳。

3 結(jié)論與討論

本文采用超聲波-生物酶協(xié)同法對(duì)紫薯色素進(jìn)行提取，利用吸光度大小來衡量提取效果。從單因素試驗(yàn)中得到如下結(jié)論：選用半纖維素酶提取效果要優(yōu)于纖維素酶和α-淀粉酶;吸光度隨著酶用量的增加先增大后減小，在25 U·mL-1時(shí)達(dá)到最大值;隨著酶水解時(shí)間的增加吸光度先增大后減小，在45 min后迅速下降;紫薯色素提取適合在酸性條件下進(jìn)行，隨著溶液pH值的增加吸光度呈現(xiàn)下降趨勢(shì);吸光度隨著料液比的增加先增大后減小，最佳料液比為1∶25;隨著超聲時(shí)間的增加，吸光度在20 min時(shí)達(dá)到最大然后迅速降低;吸光度隨著超聲的升高先增大后減小，在60 ℃達(dá)到最大值。通過正交試驗(yàn)得到最佳工藝為：超聲時(shí)間20 min，酶用量25 U·mL-1，pH值為4.0，色素提取量為31.72 mg·（100 g）-1。在紫外-可見吸收光譜中，紫薯色素在324 nm附近出酰基化峰，說明紫薯花青素比較穩(wěn)定，適合運(yùn)用到生活中。本文試驗(yàn)方法簡單、便捷，使用的試劑成本較低、安全性高、效果好，具有可行性。

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