GANT61對髓母細胞瘤Daoy細胞增殖、凋亡的影響及作用機制△

盧恩敏，盧恩娟，高麗京，裴立靜，王慶艷

1唐山市豐潤區人民醫院兒科，河北 唐山 063000

2唐山市豐潤區第二人民醫院兒科，河北 唐山 063000

髓母細胞瘤（medulloblastoma，MB）是兒童中最常見的中樞神經系統腫瘤[1]。目前的治療手段主要是以手術和放化療結合為主，術后患者生存率低，且多數患者常伴隨長期的放化療不良反應[2-3]。目前尚無針對性的治療藥物，研究MB發病的分子機制，探索可用于MB治療的分子生物學靶點，實現MB的靶向治療，對改善患者預后具有重要意義。音猬因子（sonic hedgehog，SHH）信號通路在胃癌、淋巴癌等多種腫瘤組織中異常激活，與腫瘤的增殖和轉移密切相關[4]，GANT61是SHH信號通路特異性的抑制劑[5]。本研究通過向人MB Daoy細胞中加入不同濃度的GANT61，觀察其對細胞凋亡標志物胱天蛋白酶3（caspase 3）、細胞周期標志物p21和細胞周期蛋白D1（cyclin D1）及SHH信號通路下游的核轉錄因子GLI家族鋅指蛋白 1（GLI family zinc finger 1，GLI1）和 GLI家族鋅指蛋白 2（GLI family zinc finger 2，GLI2）的影響，旨在為臨床治療MB提供新的思路，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人MB Daoy細胞株購自美國模式菌種收集中心（American Type Culture Collection，ATCC）。GANT61購自美國Abcam公司。相差顯微鏡購自德國Leica公司，多功能酶標儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司，聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀購自蘇州東勝興業科學儀器有限公司，凝膠成像裝置、電泳儀電源、轉膜裝置均購自上海天能科技有限公司。二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）和噻唑藍（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）均購自上海恒斐生物科技有限公司；β-肌動蛋白（β-actin）抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司，cyclin D1抗體購自美國CST公司，p21、caspase 3抗體均購自美國Abcam公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒和碘化丙啶（propidium iodide，PI）染料均購自上海碧云天生物技術有限公司。MiniBEST Universal RNA Extraction Kit購自日本TaKaRa公司，TaqMan Small RNA Assays試劑盒購自美國Life公司。

1.2 細胞培養

從液氮罐中取出人MB Daoy細胞后，置于37℃水浴鍋中復蘇細胞。離心去除凍存液（胎牛血清∶DMSO=9∶1）后接種至含有10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640培養液中，于5%CO2、37℃無菌培養箱中培養細胞。每隔1天換1次液。每隔2～3天傳代1次。

1.3 實驗分組

細胞在正常狀態下培養24 h后進行分組，共分為4組。A組：培養液中加入0.1%DMSO；B組：培養液中加入10 μmol/L GANT61 和0.1%DMSO；C組：培養液中加入20 μmol/L GANT61和0.1%DMSO；D組：培養液中加入40 μmol/L GANT61和0.1%DMSO。

1.4 MTT 法檢測細胞增殖

分別于4組細胞培養0、24、48 h后，吸出培養基，加入含5 mg/ml MTT的新鮮DMEM培養基100 μl，37℃恒溫條件下繼續培養4 h，應用酶標儀于570 nm波長處檢測各孔的光密度（optical density，OD）值。

1.5 實時定量PCR檢測GLI1mRNA、GLI2mRNA的相對表達量

采用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取細胞中的RNA，然后按照TaqMan Small RNA Assays說明書合成cDNA。以cDNA為模板進行實時定量PCR。反應條件：95℃5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共40個循環。GLI1mRNA上游引物為5'-CAGGGAGGAAAGCAGACTGAC-3'，下游引物為5'-GGCTTGGCTGTGGCTTCA-3'；GLI2mRNA上游引物為5'-CAACCAGAACAAGCAGAGCA-3'，下游引物為5'-ACCTCAGCCTCCTGCTTACA-3'。以β-actin為 內參，采用2-△△Ct法計算GLI1mRNA、GLI2mRNA的相對表達量?！鳌鰿t=（Ct目的基因-Ct內參基因）實驗組-（Ct目的基因-Ct內參基因）對照組。

1.6 蛋白質印跡法（Western blot）檢測cyclin D1、p21、caspase3蛋白的表達情況

加入適量RIPA裂解液裂解細胞，低溫離心，取上清液采用BCA試劑盒進行蛋白定量，配制10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，電泳至溴酚藍跑出膠面，轉膜，5%脫脂牛奶室溫封閉，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，電化學發光法曝光顯影，以β-actin為內參，進行半定量分析。

1.7 流式細胞術檢測細胞周期

4組細胞培養72 h后，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌細胞，胰蛋白酶消化，收集細胞制成單細胞懸液，70%乙醇固定6 h，加入l ml PI后于4℃冰箱中染色30 min，上機檢測每組樣本的DNA含量。應用MuticycleAV分析軟件對每組樣本的細胞周期進行擬合分析。

1.8 統計學分析

采用SPSS 21.0軟件對數據進行統計分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞增殖情況的比較

培養24 h后，C組和D組細胞的OD值均低于A組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；培養48 h后，C組和D組細胞的OD值均低于A組，D組細胞的OD值低于B組和C組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

表1 培養0、24、48 h后4組細胞增殖情況的比較（±s）

表1 培養0、24、48 h后4組細胞增殖情況的比較（±s）

注：a與A組比較，P＜0.05；b與B組比較，P＜0.05；c與C組比較，P＜0.05

組別A組B組C組0.103±0.014 0.112±0.025 0.103±0.035 0.553±0.039 0.443±0.014 0.352±0.130a 0.761±0.121 0.552±0.121 0.364±0.014a D組OD值0 h 0.113±0.014 24 h 0.235±0.043a 48 h 0.140±0.013a b c

2.2 GLI1mRNA、GLI2mRNA 相對表達量的比較

4組細胞中GLI1mRNA、GLI2mRNA的相對表達量比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）。C組和D組細胞中GLI1mRNA和GLI2mRNA的相對表達量均低于A組，D組細胞中GLI1mRNA和GLI2mRNA的相對表達量均低于B組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表2）

表2 4組細胞中GLI1 mRNA、GLI2 mRNA相對表達量的比較

2.3 cyclin D1、p21、caspase3蛋白表達情況的比較

4組細胞中cyclin D1、p21、caspase 3蛋白表達水平比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）。C組和D組細胞中cyclin D1蛋白表達水平均低于A組和B組，p21、caspase 3蛋白表達水平均高于A組和B組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表3）

表3 4組細胞中cyclin D1、p21、caspase 3蛋白表達水平的比較（±s）

表3 4組細胞中cyclin D1、p21、caspase 3蛋白表達水平的比較（±s）

注：a與A組比較，P＜0.05；b與B組比較，P＜0.05

組別A組B組C組D組F值P值cyclin D1 0.734±0.232 0.721±0.183 0.442±0.171a b 0.284±0.009a b 16.622 0.000 p21 1.153±0.122 1.022±0.315 1.866±0.231a b 1.865±0.212a b 38.530 0.000 caspase 3 0.975±0.144 0.862±0.233 1.366±0.148a b 1.385±0.234a b 18.941 0.000

2.4 細胞周期分布情況的比較

B組、C組和D組中G0/G1期細胞比例均高于A組，G2/M期細胞比例均低于A組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；C組和D組中G0/G1期細胞比例均高于B組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表4）

表4 4組細胞中細胞周期分布情況的比較（%，±s）

表4 4組細胞中細胞周期分布情況的比較（%，±s）

注：a與A組比較，P＜0.05；b與B組比較，P＜0.05

組別A組B組C組D組F值P值43.816±5.873 56.653±6.810a 58.355±8.922a b 60.383±7.134a b 10.592 0.000 35.453±2.534 33.342±3.210 30.564±5.376 31.223±6.341 2.291 0.095 20.423±4.223 10.726±4.645a 10.544±1.637a 8.326±2.134a 24.924 0.000 G0/G1期S期G2/M期

3 討論

MB嚴重影響著世界兒童的健康，每年死亡人數約達10萬，但是具體的發病機制仍不清楚[6]。研究發現，SHH信號通路的上下游出現異常激活均可導致腫瘤的發生發展。SHH信號通路在胃癌中過度激活與胃癌的發展及轉移相關，SHH信號通路抑制劑可降低胃癌細胞的侵襲能力[7]。GLI1和GLI2是SHH信號通路下游的核轉錄因子，發揮關鍵的轉錄激活作用，在腫瘤中表達升高并參與腫瘤的發生發展[8]。研究表明，GLI的特異性抑制劑GANT61可抑制膠質母細胞瘤中的SHH信號通路，對膠質母細胞瘤的細胞周期調控和細胞增殖具有重要影響[9]。細胞周期調控及細胞凋亡與腫瘤的發生發展密不可分，細胞周期調控失常可導致腫瘤細胞的增殖能力增強。cyclin D1基因位于人染色體11q13，是細胞周期蛋白家族成員之一。cyclin D1是調控細胞周期的重要蛋白，在正常組織中低表達或不表達，在許多組織的癌變過程中，可檢測到cyclin D1的表達上調，它是評價腫瘤發生發展及轉移的重要指標。目前認為，cyclin D1是調控G期至S期最關鍵的細胞周期蛋白，細胞周期抑制蛋白p21可抑制cyclin D1的活性，從而導致細胞周期阻滯[10-11]。細胞凋亡是多基因多階段嚴格調控的過程。caspase 3是半胱氨酸蛋白酶家族成員之一，是細胞凋亡的標志性蛋白，能夠反映細胞的凋亡水平。有研究表明，caspase 3可以被cyclin D1、p21、GLI1激活，caspase 3被激活后，可使細胞核及細胞骨架中的重要蛋白酶失活，誘導凋亡小體形成，促進細胞凋亡[12-15]。

本研究結果顯示，GANT61可顯著抑制人MB Daoy細胞的生長，具有抑制MB細胞增殖的作用。進一步研究發現，GANT61能夠抑制SHH信號通路下游的關鍵靶點GLI1和GLI2mRNA水平。Western blot結果顯示，GANT61對細胞周期的關鍵蛋白cyclin D1有下調作用，對于p21及caspase 3有上調作用，說明GANT61具有阻滯細胞周期和促進細胞凋亡的作用。進一步研究GANT61對MB細胞周期的阻滯作用，結果發現，與單獨應用DMSO相比，GANT61可阻滯更多腫瘤細胞于G0/G1期。本研究推測GANT61調控細胞周期和抗腫瘤的機制可能主要是通過抑制GLI1mRNA和GLI2mRNA水平進而影響cyclin D1、p21、caspase 3蛋白表達來實現。

綜上所述，GLI1抑制劑GANT61對MB細胞具有抑制細胞增殖和促進細胞凋亡的作用，主要是通過調節GLI1和GLI2的mRNA水平進而影響cyclin D1、p21、caspase 3蛋白表達來實現。目前的研究結果提示，GANT61有望成為臨床治療MB的新藥物。