子宮內膜癌組織中錯配修復蛋白的表達情況及與患者免疫功能和微衛星不穩定的關系

于文亮，潘長清，鄭茜文

綿陽市中心醫院婦產科，四川 綿陽 621000

子宮內膜癌是一類常見的婦科惡性腫瘤，研究顯示其發病率居全部婦科惡性腫瘤的首位[1-2]。國內流行病學調查顯示，2015年中國子宮內膜癌新發病例超過6萬例，發病率僅次于宮頸癌[3]。腫瘤微環境是指腫瘤細胞發生發展所處的內外環境，其在腫瘤細胞侵襲、轉移及預后中均具有重要意義[4-6]。腫瘤微環境中的淋巴細胞，尤其是T淋巴細胞，對患者預后具有重要意義。影響腫瘤微環境淋巴細胞浸潤水平的因素十分復雜，臨床上認為新抗原的產生可能是其機制之一，而錯配修復（mismatch repair，MMR）蛋白與新抗原的產生密切相關[7]。有研究表明，存在MMR蛋白缺失的結直腸癌組織中淋巴細胞浸潤水平顯著高于MMR蛋白表達的結直腸癌組織[8]，但目前尚無研究報道在子宮內膜癌中是否存在相似的現象。自1981年首次提出微衛星不穩定（microsatellite instability，MSI）的概念后，大量研究者關注其在腫瘤發生發展中的作用，并探討其與MMR蛋白表達的相關性，但目前關于其與子宮內膜癌的研究報道較少?；诖?，本研究通過分析子宮內膜癌中常見的4種MMR蛋白（PMS2、MLH1、MSH2、MSH6）的表達情況，并探討MMR蛋白表達情況與患者免疫功能及MSI的關系，旨在為臨床上評價患者預后提供依據，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2011年3月至2018年3月于綿陽市中心醫院確診的82例子宮內膜癌患者。納入標準：①經病理檢查診斷為子宮內膜癌；②在確診前半年內未接受過相應的腫瘤治療或激素治療；③未合并其他嚴重疾病。排除標準：①合并免疫系統、內分泌系統及其他系統嚴重疾?。虎谝缽男圆?；③既往有子宮或宮頸手術史。82例患者的年齡為31～59歲，平均年齡為（43.8±5.4）歲；非子宮內膜腺癌8例（漿細胞癌5例，透明細胞癌3例），子宮內膜腺癌74例；國際婦產科聯盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期：Ⅰ期55例，Ⅱ期13例，Ⅲ期12例，Ⅳ期2例。采集患者的病理組織制成石蠟標本，并分為2份，一份用于免疫組織化學染色，另一份用于提取DNA并進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR），同時采集患者的正常子宮內膜組織作為對照。本研究經醫院倫理委員會批準，所有患者及家屬均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色 將組織蠟塊連續切取3～5 μm厚切片，采用免疫組化Envision二步法進行檢測。切片通過脫水和水化后，進行熱修復，然后加入3%H2O2溶液避光孵育20 min。采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）清洗3次，每次5 min。加入一抗溶液（MLH1抗體稀釋度為1∶50，MSH2抗體稀釋度為1∶200，MSH6抗體稀釋度為1∶150，PMS2 抗體稀釋度為1∶50，CD4+抗體稀釋度為 1∶200，CD8+抗體稀釋度為 1∶150），置于4℃冰箱中避光孵育過夜。PBS清洗3次，每次5 min，加入生物素標記的二抗，37℃避光孵育30 min。PBS清洗3次，每次5 min。通過現配的二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）溶液進行顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片，于光學顯微鏡下進行觀察?？贵w均購自上海碧云天生物技術有限公司。采用已知的陽性片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.2 PCR 提取腫瘤組織DNA，檢測5個微衛星標記，引物序列購自北京鼎國昌盛生物科技有限責任公司（表1）。擴增條件：95℃預變性15 min；94℃變性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，共32個循環；72℃延伸25 min。4℃保存。將擴增后的微衛星片段經95℃變性5 min后進行毛細管電泳，采用Gene Mapper4.1對微衛星片段進行分析。

1.3 結果判定

1.3.1 MMR蛋白表達缺失判定 MMR蛋白MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的表達定位于細胞核，黃色或棕褐色為陽性，陰性即為表達缺失。判讀結果時，應注意內對照的選擇，非腫瘤性的內膜間質、腺體及淋巴細胞核應棕黃色陽性著色。只有在內對照陽性背景下的腫瘤細胞核的表達完全缺失才能認為有效，此外還應注意對腫瘤組織區域進行評估，而不應選擇非腫瘤區域如增殖癥區域[9-10]。

表1 MSI位點的引物序列

1.3.2 T淋巴細胞浸潤情況 CD4+和CD8+的表達定位于淋巴細胞膜，棕黃色為陽性。每張切片隨機檢閱至少5個高倍鏡（×400）視野，每個視野至少計數200個細胞。取5個區域淋巴細胞數平均值。

1.3.3 MSI 陽性判定 腫瘤組織和同一患者的正常組織DNA在同一條件下電泳，若出現完全一致的電泳條帶，則為MSI陰性，若出現條帶的移動、缺失或額外條帶，則為MSI陽性。

1.4 統計學分析

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析，計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法；計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MMR 蛋白表達缺失情況

82例子宮內膜癌患者中，PMS2、MLH1、MSH2、MSH6蛋白表達缺失例數分別為8例、7例、6例和13例，蛋白表達缺失率分別為9.8%、8.5%、7.3%、15.9%?？偟鞍妆磉_缺失率為35.4%（29/82），其中單個蛋白缺失24例，2個蛋白聯合缺失5例（3例MLH1/PMS2蛋白缺失，2例MSH2/MSH6蛋白缺失）。

2.2 不同臨床特征子宮內膜癌患者中MMR蛋白表達缺失情況的比較

不同FIGO分期、浸潤深度子宮內膜癌患者中MMR蛋白表達缺失率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。年齡＞50歲、有淋巴結轉移子宮內膜癌患者中MMR蛋白表達缺失率分別明顯高于年齡≤50歲、無淋巴結轉移的患者，差異均有統計學意義（P＜0.01）。子宮內膜腺癌患者中MMR蛋白表達缺失率明顯高于非子宮內膜腺癌患者，差異有統計學意義（P＜0.01）；低分化子宮內膜腺癌患者中MMR蛋白表達缺失率明顯高于中分化和高分化子宮內膜腺癌患者，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表2）

表2 不同臨床特征子宮內膜癌患者中MMR蛋白表達缺失情況的比較（n=82）

2.3 MMR 蛋白表達缺失和未缺失子宮內膜癌患者中CD4+及CD8+水平的比較

MMR蛋白表達缺失患者的CD4+水平為（74.27±10.26）%，明顯高于MMR蛋白表達未缺失患者的（35.91±8.42）%，差異有統計學意義（t=18.237，P＜0.01）；MMR蛋白表達缺失患者的CD8+水平為（70.31±6.32）%，明顯高于MMR蛋白表達未缺失患者的（35.28±10.97）%，差異有統計學意義（t=18.341，P＜0.01）。

2.4 不同臨床特征子宮內膜癌患者中MSI發生情況的比較

82例患者中，MSI陽性17例，陽性率為20.73%。年齡＞50歲子宮內膜癌患者的MSI陽性率高于年齡≤50歲的患者，差異有統計學意義（P＜0.05）；子宮內膜腺癌患者的MSI陽性率高于非子宮內膜腺癌患者，低分化子宮內膜腺癌患者的MSI陽性率低于中分化和高分化子宮內膜腺癌患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。不同FIGO分期、浸潤深度、淋巴結轉移情況子宮內膜癌患者的MSI陽性率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表3）

2.5 MSI與MMR 蛋白表達的關系

17例MSI陽性患者中，MMR蛋白表達缺失15例，缺失率為88.24%，65例MSI陰性患者中，MMR蛋白表達缺失14例，缺失率為21.54%。MSI陽性患者中MMR蛋白表達缺失率明顯高于MSI陰性患者，差異有統計學意義（χ2=26.225，P＜0.01）。

表3 不同臨床特征子宮內膜癌患者中MSI情況的比較（n=82）

3 討論

MMR基因具有保守性，而這一特性在基因組的穩定性以及DNA復制的忠誠性中具有重要意義。突變的MMR蛋白可能會增加腫瘤的發生風險，其可能的機制為突變導致MSI或錯誤復制引起基因組不穩定，進而促進癌基因與抑癌基因異常表達，最終導致某些細胞的無序及無限制增殖[11-12]。研究發現，子宮內膜癌細胞中MMR基因突變率較高，其可能的原因為當MMR基因發生突變時，MMR蛋白表達過低或缺失，造成MMR修復功能障礙，而由于機體難以及時修復DNA復制過程中的異常，從而導致“滑鏈錯配”、復制差錯、染色體互換不均勻等的發生，造成微衛星DNA的長度改變，引發MSI，最終對細胞的正常增殖造成一定影響，為腫瘤的發生發展提供了有利環境，同時癌基因和抑癌基因異常表達也會誘發腫瘤組織的形成[13-14]。流行病學調查顯示，具有MMR基因突變的女性子宮內膜腺癌的發生風險為40%～60%，而在正常人群中，這一比例僅約2.3%[15]。子宮內膜癌組織中不同MMR蛋白表達的缺失率不同，MLH1蛋白表達缺失率為24%～28%，MLH2為7%～8%，MLH6為6%～21%，PMS2為28%～40%[16-17]。本研究結果顯示，82例子宮內膜癌組織中，PMS2、MLH1、MSH2、MSH6蛋白表達缺失率分別為9.8%、8.5%、7.3%、15.9%，總蛋白表達缺失率為35.4%，與上述研究結果較為一致。

影響MMR蛋白表達缺失的因素十分復雜，有研究報道，相較于年齡低于50歲的子宮內膜癌患者，年齡超過50歲的子宮內膜癌患者MMR蛋白表達缺失率更高。本研究結果顯示，年齡＞50歲、有淋巴結轉移子宮內膜癌患者中MMR蛋白表達缺失率分別明顯高于年齡≤50歲、無淋巴結轉移的患者，差異均有統計學意義（P＜0.01）。晉薇等[18]研究顯示，高FIGO分期、深肌層浸潤以及有淋巴結轉移的子宮內膜癌患者MMR蛋白表達缺失率較高。本研究結果顯示，MMR蛋白表達缺失均發生在子宮內膜腺癌患者中，不同FIGO分期、浸潤深度子宮內膜癌患者中MMR蛋白表達缺失率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），與上述研究結果不同，可能與人種和地域因素有關。本研究結果還顯示，低分化子宮內膜腺癌患者中MMR蛋白表達缺失率明顯高于中分化和高分化子宮內膜腺癌患者，差異均有統計學意義（P＜0.01）。

MSI是由于機體MMR系統喪失導致復制錯誤的結果，常見于遺傳性腫瘤，在散發性腫瘤中也存在一定比例的MSI陽性率。有研究報道，MSI與患者性別、腫瘤分化程度、淋巴結轉移情況及腫瘤浸潤深度均無相關性。彭俊玲等[19]研究發現，MSI與散發性結直腸癌患者的年齡有關；而趙巖等[20]研究顯示，子宮內膜癌組織中MSI與腫瘤分期、淋巴結轉移、肌層浸潤深度無關，但MSI更傾向發生于分化程度高及子宮內膜腺癌組織中。本研究結果顯示，年齡＞50歲子宮內膜癌患者的MSI陽性率高于年齡≤50歲的患者，子宮內膜腺癌患者的MSI陽性率高于非子宮內膜腺癌患者，低分化子宮內膜腺癌患者的MSI陽性率低于中分化和高分化子宮內膜腺癌患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。不同FIGO分期、浸潤深度、淋巴結轉移情況子宮內膜癌患者的MSI陽性率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

研究認為，MMR蛋白表達缺失的患者往往預后較好，其可能的機制為MMR蛋白表達缺失的組織中，微衛星序列突變率上升，進而促進機體產生新的肽段，而其中一些肽段作為新抗原可被機體免疫系統識別并處理，從而增強機體的免疫應答，導致免疫細胞尤其是T淋巴細胞浸潤增多[21]。已有研究發現，在結直腸癌以及非小細胞肺癌中，具有MMR蛋白表達缺失的患者淋巴細胞浸潤有所增加[9]，而MSI與MMR蛋白表達缺失密切相關[19-20]。張學華等[22]研究發現，MMR蛋白表達缺失子宮內膜癌患者中CD4+的水平顯著高于MMR蛋白表達未缺失的患者。本研究結果顯示，MMR蛋白表達缺失患者的CD4+、CD8+水平均明顯高于MMR蛋白表達未缺失的患者，差異均有統計學意義（P＜0.01）。MSI陽性患者中MMR蛋白表達缺失率為88.24%，明顯高于MSI陰性患者的21.54%，差異有統計學意義（P＜0.01）。說明MMR蛋白表達缺失的子宮內膜癌組織中有大量免疫細胞浸潤，患者的免疫功能有所提高，而MMR蛋白表達缺失可能參與MSI的發生，提示其可作為評價子宮內膜癌預后的指標。然而，本研究具有一定的局限性，樣本量較小，且未對不同缺失蛋白的病例進行分層分析。因此，仍需加大樣本量進行進一步研究。

綜上所述，MMR蛋白在子宮內膜癌的發生發展中具有重要作用，年齡＞50歲、低分化、有淋巴結轉移的子宮內膜癌患者中MMR蛋白表達缺失率較高。MMR蛋白表達缺失的組織中有大量免疫細胞浸潤，患者的免疫功能有所提高。