三種不同材料修復大鼠口腔黏膜缺損創面的對比實驗研究

韓永潔，劉世杰，鄧 露

(青海省人民醫院頜面外科，青海 西寧 810007)

口腔黏膜是抵抗機械刺激、毒性物質及微生物入侵的重要結構，對于口腔功能的維持具有重要意義，而外傷、口腔黏膜良性及惡性改變均可造成黏膜缺損，造成一定功能障礙[1]。目前口腔黏膜缺損及重建主要依靠自體皮片移植、帶蒂的肌皮瓣等方式完成，但均具有明顯的局限性，一方面自體取皮可加重患者的創面損傷，增加其痛苦，另一方面自體移植的成活率較低，效果不佳[2]。組織工程技術是將功能相關的種子細胞通過體外培養后種植于天然可降解生物材料上，將二者培養的產物植入人體缺損部位，在人體條件下，種子細胞增殖、分化形成特定形態、功能的器官或組織，而支架材料則逐漸被降解[3]。成纖維細胞是口腔黏膜固有層的基本組成細胞，其具有合成、更新基質的能力，這一特性也為口腔黏膜的組織工程培養提供了前提[4]。目前臨床常用的組織工程支架材料主要包括脫細胞真皮基質、納米纖維絲素蛋白、聚羥基乙酸、聚乳酸羥基乙酸等，這些材料均有一定優缺點及局限性。納米纖維絲素蛋白是一種天然的大分子材料，作為組織工程支架材料可較好的支持種子細胞的黏附、增殖及分化，目前已有關于其培養出神經膠質細胞、角皮細胞、上皮細胞、纖維原細胞的研究，且這些研究均顯示該材料培養下的細胞生長狀態良好，結構完整[5]。本研究擬探討納米纖維絲素蛋白修復口腔黏膜的效果，并與目前臨床常見的同種(人皮)及異種(牛皮)脫細胞基質修復材料修復效果進行比較，觀察口腔黏膜生長速度、炎癥反應及相關蛋白的表達情況，旨在為納米纖維絲素蛋白修復口腔黏膜缺損提供理論依據。現報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗材料：實驗動物：80只3月齡雄性Wister清潔級大鼠，體重220～250g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物適應性喂養1周，保持環境溫度適宜。本研究經本單位實驗動物倫理委員會批準，符合動物保護及使用相關規定。主要實驗儀器：石蠟切片機(德國Leika公司)；倒置相差電子顯微鏡，光學顯微鏡(日本Olympus公司)。主要實驗試劑：同種異型脫細胞基質購自北京清源生物科技有限公司，異種脫細胞基質購自正海生物技術有限公司，納米纖維絲素蛋白購自武漢博士德公司；抗CD34兔抗大鼠抗體、廣譜細胞角蛋白抗體、羊抗鼠通用抗體、SABC通用免疫組化試劑盒購自武漢博士德有限公司。

1.2實驗方法：動物分組及處理：①動物分組：將大鼠隨機分為A(納米纖維絲素組，n=20)、B(牛皮脫細胞基質組，n=20)、C(人皮脫細胞基質組，n=20)、D組(空白對照組，n=20)。②動物建模及處理：采用3.6%水合氯醛腹腔注射麻醉，常規消毒鋪巾，麻醉成功后各組大鼠均于顯微鏡下手術切除直徑10mm的全層口腔頰黏膜，充分止血。A、B、C組大鼠分別取同一直徑(10mm)、經輻照滅菌的絲素蛋白、異種(牛皮)脫細胞基質、同種(人皮)脫細胞基質反鋪于單層凡士林紗布上，用7-0縫線將紗布縫合于口腔黏膜，取凡士林油紗布覆蓋，0號絲線縫合固定；D組大鼠用凡士林紗布覆蓋，用0號絲線縫合。術后大鼠常規分籠飼養，不進行抗感染治療，自由飲食，術后7d拆線，保持鼠籠清潔。

1.3標本取材及指標檢測：黏膜狀態觀察：觀察各組大鼠全身狀態，術后1周每組大鼠隨機挑選5只大鼠，常規腹腔麻醉后觀察口腔黏膜色澤、滲出液情況、愈合情況，采用游標卡尺測定口腔黏膜缺損直徑，測定時取三個不同位點測定，取平均值，測量完畢后標記大鼠，于術后2周、3周、4周時進行測量。HE染色：于術后1、2、3、4周時每組挑選5只大鼠，常規處死，取5×5mm口腔黏膜創面組織，取材后迅速采用10%福爾馬林固定。固定標本切取3mm×3mm大小，常規石蠟包埋，采用切片機切取4μm切片，經烤片、脫蠟、梯度酒精逐級復水、蘇木素染色、沖洗、分化、伊紅復染、脫水、透明等操作后，以中性樹膠封片，采用普通光學顯微鏡進行組織的觀察，先于低倍鏡下找到合適的視野再進行高倍鏡觀察。免疫組化：取4μm石蠟切片，烤片后采用二甲苯脫蠟，磷酸緩沖液(PBS)沖洗，滴加0.3%過氧化氫甲醇溶液50μL滅活過氧化物酶處理10min，微波修復抗原10min，PBS沖洗3次，滴加50μL山羊血清，孵育10min，加入標記的一抗(CD34兔抗鼠單克隆抗體，小鼠抗大鼠CK單抗，陰性對照滴加PBS溶液)室溫孵育1h，PBS沖洗3次，滴加標記的二抗(生物素標記的羊抗鼠通用抗體)，室溫孵育10min，PBS沖洗3次，滴加50μL辣根標記鏈霉卵白素(SP)工作液，孵育10min，PBS沖洗3次，加入DAB顯色液，采用蒸餾水沖洗，蘇木精復染后用0.1%鹽酸溶液分化，PBS沖洗，經梯度酒精脫水、透明后封片，顯微鏡下觀察并拍照。

2 結 果

2.1各組大鼠術后不同時間點黏膜狀態情況：術后1周時觀察各組大鼠頰側黏膜縫線均無脫落；A、B、C組大鼠術后1周拆線后可見移植區有少量新生上皮，創面見透明膜狀物，周圍無明顯紅腫；術后3周時A組可見創面新生黏膜與周圍組織無明顯界限，部分大鼠創面未完全愈合，B、C兩組創口直徑收縮較大，少量創面未愈合。經比較，術后1、2、3周時D組大鼠創面直徑顯著大于A、B、C組，差異具統計學意義(P<0.05)。詳見圖1、表1。

圖1 術后各組大鼠不同時間點創面直徑大小情況

表1 術后各組時間點創面直徑大小變化

2.2HE染色觀察各組大鼠術后不同時間點成纖維細胞密度、炎性細胞數情況：HE染色顯示，A、B、C組大鼠不同時間點成纖維細胞數、炎性細胞數均顯著低于D組，差異具統計學意義(P<0.05)；A、B、C組大鼠各時間點組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。詳見圖2、圖3、表2、表3。

圖2 術后各組大鼠不同時間點黏膜HE染色情況

圖3 術后各組大鼠不同時間點黏膜CK染色情況

表2 四組新生組織中成纖維細胞密度比較(cell/高倍視野

表3 四組新生組織中炎性細胞密度比較(cell/高倍視野

2.3各組大鼠黏膜CK染色情況分析：免疫組化CK染色顯示，術后各組黏膜均有上皮細胞生長，A、B、C組術后1、2、3、4周時大鼠CK陽性細胞表達數顯著高于D組，差異具統計學意義(P<0.05)；A、B、C組大鼠各時間點組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表4。

表4 四組大鼠不同時間點CK陽性細胞數比較(cell/高倍視野

2.4各組大鼠術后黏膜組織中CD34染色情況分析：免疫組化CD34染色顯示，A、B、C組術后1、2、3周時CD34陽性表達數顯著高于D組(P<0.05)，術后4周各組CD34表達情況比較差異無統計學意義(P>0.05)，A、B、C組大鼠各時間點組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。詳見圖4、表5。

圖4 術后各組大鼠不同時間點黏膜CD34染色情況

表5 四組新生組織中CD34陽性細胞比較(cell/高倍視野

3 討 論

目前認為理想的組織工程修復材料需具備以下幾個要點：良好的生物相容性、良好的可降解性、可控的降解速度、優良的三維孔隙結構及來源便捷，其中良好的生物相容性是必備條件。本研究中采用納米纖維絲素蛋白、人皮脫細胞基質、牛皮脫細胞基質的組別在術后1周即出現創面的愈合，且術后1、2、3周時創面愈合程度顯著優于空白對照組，提示三種材料均由較好的組織修復效果。三種材料對于創面愈合的影響比較結果顯示，三種材料各時間點創面大小無明顯差異，提示三種材料促進創面愈合的速率相當。既往王忠朝[6]等開展的一項動物研究顯示，采用納米纖維絲素蛋白、自體、異體細胞基質的大鼠術后3、5、7d時口腔黏膜缺損均顯著低于空白對照組，另外納米纖維絲素蛋白組大鼠黏膜缺損直徑也顯著低于自體、異體細胞基質；而國外一項研究證實，納米纖維絲素蛋白、人皮脫細胞基質對口腔黏膜的修復及再生有相當的作用效果[7]，本研究與后者研究結果類似，與前者研究結果存在一定差異的原因可能為本研究與其觀測時間點不同所致，另外也有研究表明，不同材料修復黏膜的速率可能存在較大差異，而本研究中未對術后7d內黏膜修復情況進行分析。

口腔黏膜與皮膚一般結構類似，成纖維細胞是口腔黏膜固有層的基本組成細胞，現有研究表明，口腔黏膜的成纖維細胞在上皮形成及上皮、真皮之間的黏附作用發揮重要作用，同時也可影響上皮細胞的增殖分化及內皮細胞的遷移過程。本研究對各組大鼠術后黏膜成纖維細胞、毛細血管內皮細胞進行分析，結果顯示與空白對照組比較，采用納米纖維絲素蛋白、自體、異體細胞基質的大鼠術后1、2、3、4周時成纖維細胞密度較高；納米纖維絲素蛋白、自體、異體細胞基質組間比較差異無統計學意義，提示納米纖維絲素蛋白在促進成纖維細胞增殖方面有較好的效果，可能為促進創面預后的機制之一。既往開展的一項動物研究表明，絲素纖維蛋白支架用于構建口腔黏膜固有層效果較好，大鼠口腔成纖維細胞可在支架表面黏附、增殖、生長并逐漸形成黏膜，促進上皮生長。本研究與其研究結果類似。口腔黏膜損傷可造成機體炎癥反應的增加，有研究表明，與皮膚愈合過程不同的是，口腔黏膜愈合過程中的炎癥呈一過性進展。本研究對黏膜損傷大鼠黏膜炎癥細胞進行分析結果顯示，各處理組大鼠炎癥細胞顯著低于空白對照組大鼠，與成纖維細胞數量變化趨勢類似，各處理組炎癥細胞數比較也無統計學意義。分析納米纖維絲素蛋白、自體、異體細胞基質對機體炎癥反應的機制，一方面，與空白對照組比較，各處理組別大鼠創面愈合過程較快，降低創面持續刺激引起的炎癥反應升高；另一方面，既往研究認為，成纖維細胞除合成膠原、構成組織連接成分外，其也可輔助炎癥反應過程，促進炎癥的消退，這一特性可能是各材料對炎癥細胞有一定影響的原因。

另外，本研究采用免疫組化進行CD34、CK染色分析各組大鼠各時間點血管內皮細胞及黏膜上皮細胞的生長情況，結果顯示，各組大鼠黏膜CD34陽性表達顯著高于D組，提示在納米纖維絲素蛋白、自體、異體細胞基質等支架的作用下，黏膜血管內皮得到更好的生長，考慮可能為生物支架材料可為毛細血管內皮細胞長入提供基礎。CK染色顯示各組大鼠創緣早期均有上皮細胞生長，而D組僅有少量上皮細胞，術后1、2、3周時創面的新生上皮細胞顯著多于D組，進一步提示采用納米纖維絲素蛋白、自體、異體細胞基質修復口腔黏膜缺損有助于上皮生長，對重建黏膜缺損有較好的價值。

綜上，納米纖維絲素蛋白、自體、異體細胞基質對大鼠口腔黏膜損傷具有相當的修復效果，但脫細胞基質在來源方面比較少，且存在倫理學的限制；現有的脫細胞基質在使用過程中多價格較為昂貴，患者難以承受；另外其也有引起傳染性疾病傳播的弊端，納米纖維絲素蛋白具有相對較廣的來源，為口腔黏膜缺損修復提供新的思路。