男性miR-221/222基因多態性與心力衰竭的關系

樊春紅，陳曉寧

(北京大學人民醫院檢驗科，北京 100044)

心血管疾病是人類健康的巨大威脅，特別在老年患者中，各種原因導致的心肌重塑最終均可轉變為心力衰竭。而當心力衰竭出現后，其病死率顯著增加。然而，由于缺乏較好的心力衰竭預測指標，常不能在心衰發生前采取有效的干預措施。因此，發現新的心衰預測標志物，對于預防心力衰竭的發生有重要意義。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類有調控作用的非編碼RNA，通常有21～23個核苷酸組成。它們通過與靶基因的3'非翻譯區(3'UTR)結合而發揮其負性調控作用。近來研究發現，多種miRNA參與心肌重塑及心力衰竭的調控。已有研究發現，miR-221/222在心肌重塑動物模型過程中發揮著重要作用[1]。然而miR-221/222表達的調控及其與人心力衰竭的關系并不清楚。單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)廣泛存在于基因組中。體內SNP位點的變異在多種疾病的發生、發展及治療過程中有重要的調控作用。因此，某些有關鍵功能基因的SNP位點常用于相應疾病的檢測及用藥指導[2,3]。SNP對于miRNA的功能也有重要影響。一方面，miRNA自身編碼基因出現的SNP可影響其剪切及結合；另一方面，發生在靶基因結合位點的SNP也可影響其結合作用。因此，本研究以miR-221/222為目標，分析SNP對其表達的影響，并探討與心力衰竭的關系，旨在發現新的心衰預測指標，為本病的防治提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1研究對象:分別取自2010年至2018年在本院住院且經診斷為心力衰竭的男性患者共100例，平均年齡64.2±5.2歲；對照組為同期體檢的健康男性，經年齡匹配后共入組100例，平均年齡59.5±8.7歲，經統計學分析，兩組間年齡無顯著性差異。

1.2樣品采集:所有研究對象均采用EDTA-K2真空采血管取晨間空腹靜脈血4mL。經2500轉/分離心后分別分離血細胞和血漿，均凍存于-80℃冰箱備用。

1.3DNA提取、PCR擴增及測序:采用酚-氯仿-異戊醇法抽提外周血白細胞，經瓊脂糖凝膠電泳鑒定合格后，采用NaNo Drop測定濃度，取部分基因組DNA，并稀釋至50ng/μL用于PCR擴增反應。采用PCR法對待測部分片段進行擴增，詳細信息見表1。依據表1中的信息進行PCR擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳判斷擴增結果，并將PCR產物采用Sanger法測序，通過所獲取的測序圖分別判斷SNP情況。

表1 本研究所采用的的引物序列及條件

1.4血漿miRNA提取及表達檢測:將血漿樣品從冰箱取出、冰上自然融化。采用mirVana血漿miR提取試劑盒(Life technologies公司)提取血漿miRNA。在提取時，每個樣品中均加入線蟲Cel-miR-39類似物作為內參一并提取。采用NaNoDrop對提取的RNA進行定量測定和質量鑒定，并將其稀釋至5ng/μL。之后，將提取出的血漿總miRNA采用ABI公司microRNA逆轉錄試劑盒分別將各組樣品中的miR-221、miR-222和Cel-miR-39進行逆轉錄。采用ABI公司的特異性TaqMan探針Real-time PCR法試劑盒檢測各樣品中的miR-221、miR-222及Cel-miR-39的Ct值，采用2-ΔΔCt法計算miR-221及miR-222在各組間的差異。

2 結 果

2.1miR-221/222基因簇SNP位點在心力衰竭中的分布:為探討miR-221/222基因簇SNP位點于心力衰竭的關系，我們首先分析了該基因簇的序列特點，篩選出rs2858059、rs2858060、rs2858061、rs113054794和rs34678647共5個候選SNP位點，經測序結果見表2。

表2 miR-221/222基因簇SNP位點各基因型在心衰及對照組中分布(n)

經分析發現，上述SNP位點均符合Hardy-Weinberg平衡，其中rs2858059、rs2858060兩個SNP位點存在顯著連鎖，且它們在兩組間分布均無差異(P>0.05)。rs113054794位點在所測的200例研究對象中僅發現C/-基因型。rs34678647位點在對照組中的比例為4%，在心衰組中占10%，兩組間分布無差異(P>0.05)。

2.2miR-221/222靶基因結合位點SNP在心力衰竭中的分布:p27及DDIT4為miR-221/222的已知靶基因[4,5]，其3'UTR區的SNP位點很可能影響miR-221/222的結合而調控心力衰竭。通過分析其結合序列發現，p27基因3'UTR區的rs182069485(G>T)位點以及DDIT4基因的rs72808106(A>G)位點很可能影響miR-221/222與該區域結合。然而，經過測序發現，位于p27基因的rs182069485在200例研究對象中全為G/G基因型，位于DDIT4基因的rs72808106在200例研究對象中全部為A/A基因型，兩者均未檢測到多態性。

2.3血漿miR-221/222水平與心力衰竭的關系:通過real-time PCR分別檢測心衰患者血漿miR-221及miR-222的差異。結果發現，兩者在心衰患者中均顯著升高(P<0.01)，見圖1。

圖1 miR-221/222在心衰患者血漿中的表達

2.4miR-221/222基因多態性對血漿表達水平的影響：我們在心衰患者中，分別按照rs2858061、rs2858060(因與rs2858059連鎖僅分析其中1個)和rs34678647基因型進行分組，觀察血漿miR-221/222的表達強度。研究發現，rs2858061、rs2858060兩個SNP位點按照各基因型分組，其患者血漿miR-221/222均無顯著差異(P>0.05)。按rs34678647位點基因型分組，miR-221表達在兩組間無顯著差異(P>0.05)，但miR-222的表達在T/-基因型中顯著高于G/-基因型，其強度分別為3.97(1.19,12.65)和0.75(0.28,3.40)。由此提示，rs34678647位點多態性很可能與心衰患者血漿miR-222的表達有關，見圖2。

圖2 心衰患者miR-221/222基因簇SNP位點對其表達的影響

3 討 論

miRNA-221/222是心肌重塑的關鍵調控分子。前期研究以轉基因動物為模型，分別研究了miR-221及miR-222對心肌重塑和心力衰竭的調控作用[1]。但其是否可作為人心力衰竭的預警標志物仍然不清楚。本研究通過SNP聯合血漿miRNA表達強度的方法，分析了miR-221/222在心力衰竭中的調控狀態，并發現血漿miR-221及miR-222的表達均在心衰患者中上調，且miR-222的表達可能受該基因簇SNP位點rs34678647調控。

人類miR-221/222基因簇位于X染色體，miR-221與miR-222編碼基因約相距700bp左右，而其編碼序列并不相同。在前期研究中也發現，心肌特異性過表達miR-221及miR-222后兩者的表型并不完全相同，且miR-222過表達后心肌重塑及心衰程度更為嚴重。本研究發現，心衰患者血漿miR-221及miR-222均升高，提示miR-221/222很可能是心衰新的預測分子。

本研究還研究了miR-221/222基因簇的SNP位點在心衰中的關系，結果發現所研究的5個SNP位點基因型分布在心衰及對照組中均無差異，表明上述5個SNP位點可能均不能作為心衰的預測位點。但是本研究發現，rs34678647位點的T基因型可顯著增強miR-222基因的表達水平，與G基因型相比，其血漿miR-222表達強度顯著升高。rs34678647位點距離miR-222編碼基因約186bp，而距離miR-221編碼基因約為1022bp。由于該位點距離miR-222基因較近，其很可能通過影響miR-222的生成調控其在血漿中的表達水平。然而，要明確該位點對miR-222表達的影響，仍需進一步通過功能研究加以驗證。

p27及DDIT4基因均為miR-221和miR-222的已知靶點[6]，且miR-221/222可通過與其靶基因3'UTR結合而調控其表達。其結合區域SNP位點的變異可顯著引起其結合強度的變化而影響miR-221/222對心肌重塑和心衰的調控作用。本研究也檢測了p27及DDIT4基因的兩個已知SNP位點，但發現這兩個SNP位點在所觀察的研究對象中均無多態性。本研究也存在一定的局限性。首先，由于miR-221/222基因簇位于X染色體，本研究僅在男性人群中觀察了相應的變化，并不能代表其調控在女性人群中的作用。其次，部分SNP位點如rs34678647，其T基因型所占比例較少，本結果仍需在大樣本研究中進行驗證。

綜上所述，血漿miR-221/222在心衰男性患者中升高，其可能是新的心衰預測指標。SNP位點rs34678647可影響心衰患者血漿miR-222的表達水平，其中T基因型患者血漿miR-222表達水平顯著上調，可能為心衰的預測提供一定依據。