復方山楂煎劑對心肌缺血模型大鼠心肌Caspase-1表達的影響※

李 月,李 想

(1.遼寧中醫藥大學附屬醫院,遼寧 沈陽110032;2.中國醫科大學腫瘤醫院/遼寧省腫瘤醫院,遼寧 沈陽110042)

心肌缺血是指心臟的血液灌注減少,引起心肌能量代謝不正常的一種病理狀態。流行病學研究顯示,與動脈粥樣硬化相關的重要危險因素為高脂血癥、高血壓等[1]。冠狀動脈粥樣硬化是指冠狀動脈壁上沉積了一層脂類,從而使冠狀動脈彈性降低、管腔變窄。其中氧化修飾的低密度脂蛋白是動脈粥樣硬化形成的關鍵環節,因此降低血脂、預防高脂血癥在防治動脈粥樣硬化形成中起著重要作用[2]。復方山楂煎劑是由山楂、延胡索、丹參、菊花、紅花、麥芽組成,本研究主要觀察復方山楂煎劑對心肌缺血模型大鼠心肌Caspase-1表達的影響,現報道如下。

1 研究材料

1.1 實驗動物 選取SPF級SD大鼠90只,雌雄各半,體質量180～220 g,購于遼寧長生生物有限公司,合格證號：SCXK(遼)2015-0001。

1.2 藥品和試劑 復方山楂煎劑由遼寧中醫藥大學藥物制劑教研室提供;脂必妥片(成都地奧九泓制藥廠,生產批號：20170914);丙基硫氧嘧啶(上海復星朝輝藥業有限公司,生產批號：20161208);豬油,市售;膽固醇(上海如吉生物科技發展公司,生產批號：20170622);膽酸鈉(中國醫藥上海化學試劑公司,生產批號：F20170428)。丙二醛(MDA)試劑盒(生產批號：20170213B),谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(生產批號：20170422),肌酸激酶(CK)試劑盒(生產批號：20170331),以上試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。維生素D3(青島雙鮮藥業有限公司),半胱天冬酶-1(Caspase-1)抗體(北京博奧森生物技術有限公司),PBS磷酸緩沖鹽(北京索萊寶科技有限公司),TMS-P超敏試劑盒(福建邁新生物技術開發有限公司),DAB顯色劑(福建邁新生物技術開發有限公司)。

1.3 實驗儀器 徠卡RM2235型切片機(德國);Be LDHmanCX-7型全自動生化分析儀(美國);島津U-3010型紫外可見分光光度計(日本);BK-P型生物組織攤片機(山東博科生物產業有限公司);DB-B1型烤片機(北京金時速儀器設備經營部);HWS-100F型恒溫恒濕培養箱(上海丙林電子科技有限公司);奧林巴斯BX43型光學顯微鏡(日本);PHS-3G型PH計(武漢天壹力儀器設備有限公司);JKDP2型電熱恒溫培養箱(廈門醫療電子儀器廠);JTS-3B型電子秤(廈門懿恒電子有限公司)。

2 方法

2.1 藥物制備 按(15∶5∶10∶3.9∶1∶15)比例稱取山楂、延胡索、丹參、菊花、紅花、麥芽共4 990 g,將以上藥物置于不銹鋼煎煮鍋中,加水10 000 m L,浸泡30 min,煮沸后,文火煎煮30 min,倒出藥液,再加水10 000 m L,再次煎煮20 min,合并兩次煎液,再濃縮至840 m L。將藥液分裝7袋,每袋120 m L,4℃保存備用,每日取1袋用于灌胃給藥,每周制備1次,中劑量和低劑量藥液由高劑量藥液按1∶2和1∶4比例稀釋所得。

2.2 造模及給藥 購入大鼠在實驗室適應性飼養1周,隨機分成空白對照組、模型對照組、復方山楂煎劑低劑量組(14.85 g生藥/kg)、復方山楂煎劑中劑量組(29.7 g生藥/kg)、復方山楂煎劑高劑量組(59.4 g生藥/kg)、脂必妥組(1.5 g/kg),空白對照組10只,其余各組每組16只,雌雄各半。空白對照組、模型對照組灌胃蒸餾水10 m L/kg,各給藥組灌胃相應藥物,每日1次,給藥體積為10 m L/kg。造模與給藥同時進行。空白對照組喂飼普通飼料,其余各組喂飼高脂飼料(膽固醇5%、豬油15%、丙基硫氧嘧啶0.2%、膽酸鈉0.2%)[3],同時每2周灌服1次維生素D315萬U/kg,實驗期間自由攝食、自由飲水,連續造模并給藥10周。除空白對照組外,其余各組大鼠于第5周皮下多點注射異丙腎上腺素(1 mg/kg·d-1),隔日1次,共注射3次[4]。

2.3 油紅O脂肪染色法及評價方法[5]剪取主動脈瓣骨髓動脈分支處的胸腹主動脈,并縱向剖開,10%甲醛固定,應用油紅O脂肪染色法,觀察實測動脈內膜脂質斑塊的面積,將主動脈內膜動脈粥樣硬化的程度分為5級。0級：內膜表面光滑,無紅染;1級：內膜有輕度紅染,但無突出表面的斑塊;2級：有明顯凸起紅染斑塊,面積＜0.5 mm2;3級：0.5 mm2≤斑塊面積≤1.5 mm2;4級：斑塊融合成片,大部分斑塊面積＞1.5 mm2;5級：斑塊幾乎覆蓋整個動脈內膜。

2.4 免疫組織化學染色 石蠟切片常規脫蠟至水。3%H2O2室溫孵育10 min,滴加10%山羊血清封閉,滴加一抗(Caspase-1抗體稀釋比例為1∶350)[6],滴加適量的辣根酶標記的鏈霉素工作液,DAB顯色劑顯色,蘇木素復染,脫水,透明,封片。免疫組化圖片采用Image J軟件進行灰度值分析,抗體表達越強,組織染色越深,灰度值越小。

2.5 統計學方法 采用SPSS 17.0統計學軟件分析數據。計量資料以均數±標準差(±s)表示,采用t檢驗;計數資料以例(%)表示,采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 觀察指標 末次灌胃給藥1 h后,各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛3 m L/kg。麻醉后腹主動脈采血,分離血清,檢測MDA、GSH-Px、CK含量。取胸腹主動脈,油紅O脂肪染色法檢測動脈內膜脂質斑塊的面積;取心臟左心室,采用免疫組化染色法檢測Caspase-1在心肌組織中的表達。

3.2 結果分析

(1)氧化應激指標比較 與空白對照組比較,模型對照組大鼠血清MDA、CK含量升高,GSH-Px含量降低,差異均有統計學意義(P＜0.05)。與模型對照組比較,復方山楂煎劑低劑量組、中劑量組、高劑量組及脂必妥組大鼠血清MDA含量降低,GSH-Px含量升高,差異均有統計學意義(P＜0.05);復方山楂煎劑中劑量組、高劑量組及脂必妥組大鼠血清CK含量降低,差異均有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血液氧化應激指標比較(±s)

表1 各組大鼠血液氧化應激指標比較(±s)

注：與空白對照組比較,△P＜0.05;與模型對照組比較,▲P＜0.05。

組別 只數 MDA(nmol/m L) CK(U/DL) GSH-Px(μ/m L)空白對照組 10 4.68±0.51 402.75±37.21 252.59±27.45模型對照組 16 12.11±1.47△ 665.16±59.16△ 136.18±12.75△復方山楂煎劑低劑量組 16 8.97±0.89▲ 608.47±54.13 180.14±15.31▲復方山楂煎劑中劑量組 16 7.24±0.59▲ 594.86±49.81▲ 196.57±18.84▲復方山楂煎劑高劑量組 16 5.97±0.63▲ 577.94±43.28▲ 225.71±24.41▲脂必妥組 16 9.09±0.97▲ 591.35±62.11▲ 175.34±19.49▲

(2)動脈粥樣硬化積分比較 與空白對照組比較,模型對照組大鼠動脈粥樣硬化積分升高,差異有統計學意義(P＜0.05)。與模型對照組比較,復方山楂煎劑中劑量組、高劑量組、脂必妥組大鼠動脈粥樣硬化積分降低,差異均有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 各組大鼠動脈粥樣硬化積分比較(分,±s)

表2 各組大鼠動脈粥樣硬化積分比較(分,±s)

注：與空白對照組比較,△P＜0.05;與模型對照組比較,▲P＜0.05。

組別 只數 動脈粥樣硬化積分空白對照組 10 0模型對照組 16 2.43±0.81△復方山楂煎劑低劑量組 16 1.80±0.65復方山楂煎劑中劑量組 16 1.41±0.53▲復方山楂煎劑高劑量組 16 1.09±0.34▲脂必妥組 16 1.69±0.62▲

(3)心肌組織中Caspase-1表達比較 與空白對照組比較,模型對照組大鼠心肌組織中Caspase-1表達升高,差異有統計學意義(P＜0.05)。與模型對照組比較,復方山楂煎劑中劑量組、高劑量組、脂必妥組大鼠心肌組織中Caspase-1表達降低,差異均有統計學意義(P＜0.05)。見表3。

表3 各組大鼠心肌組織中Caspase-1表達比較(±s)

表3 各組大鼠心肌組織中Caspase-1表達比較(±s)

注：與空白對照組比較,△P＜0.05;與模型對照組比較,▲P＜0.05。

組別 只數 Caspase-1空白對照組 10 201.57±19.36模型對照組 16 141.54±12.66△復方山楂煎劑低劑量組 16 153.13±15.18復方山楂煎劑中劑量組 16 168.55±17.48▲復方山楂煎劑高劑量組 16 175.19±21.67▲脂必妥組 16 171.93±19.47▲

4 討論

臨床中可引起心肌缺血的原因較多,其中常見的原因是冠狀動脈粥樣硬化,在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的基礎上,心肌暫時性缺血會引起血管發生痙攣[7],心肌缺氧使酸性代謝產物刺激感覺神經末梢,誘發心絞痛,冠狀動脈粥樣硬化性心臟病血管管徑狹窄達75%以上,則可發生心肌梗死[8]。本研究采用高脂飲食聯合皮下多點注射異丙腎上腺素誘發心肌缺血,既可以觀察復方山楂煎劑對高脂飲食引起冠狀動脈損傷的影響,又可以觀察復方山楂煎劑對心肌損傷模型的影響。缺氧導致心肌產生大量氧自由基,氧自由基作用于細胞膜上的不飽和脂肪酸,使膜脂質發生過氧化反應,進而導致冠狀動脈血管損傷,形成脂質過氧化物,MDA是體內重要的氧自由基的代謝產物,能較好地反映組織過氧化程度[9]。MDA是膜脂過氧化作用的產物之一,使細胞膜結構和功能受到損傷,改變膜的通透性,從而影響一系列生理生化反應的正常進行[10]。氧自由基不但可以通過生物膜中多不飽和脂肪酸的過氧化引起細胞損傷,還可以通過脂氫過氧化物的分解產物引起細胞損傷[11]。脂質氧化終產物MDA在體外影響線粒體呼吸鏈復合物及線粒體內關鍵酶活性,它的產生可以加劇膜的損傷,因而MDA的含量可反映機體脂質過氧化的程度和細胞損傷的程度[12]。GSH-Px是體內一種重要的過氧化物分解酶,GSH-Px的活性中心是硒半胱氨酸,它可以使有毒的過氧化物還原為無毒的羥基化合物,從而保護細胞膜的結構及功能不受損害。CK也稱為肌酸磷酸激酶,以心肌、平滑肌含量為多,CK主要存在于細胞質和線粒體中,與細胞內能量運轉、ATP再生、肌肉收縮有直接關系。CK活性測定可以用于心肌疾病的診斷,心肌梗死可引起CK水平病理性升高[13]。本研究通過喂飼高脂飼料10周造模,并給予相應藥物治療,結果顯示：與模型對照組比較,復方山楂煎劑組大鼠血清中MDA含量顯著降低,GSH-Px活性顯著提高,CK含量降低。表明復方山楂煎劑具有抗氧化作用,通過抗氧化減輕氧自由基對心肌細胞的損傷,進而降低損傷的心肌細胞向血液中釋放CK。

動脈粥樣硬化是指動脈內膜有脂質沉積,平滑肌細胞增生,膠原纖維增多,形成粥糜樣壞死病灶,其病理改變是在動脈內膜面形成斑塊,有脂質條紋、血栓形成和斑塊內出血等繼發病變。油紅O脂肪染色法能顯示組織內的脂肪,油紅O為脂溶性染料,在脂肪內能高度溶解,可使組織內三酰甘油等中性脂肪著色。本研究結果顯示,模型對照組大鼠動脈粥樣硬化積分顯著升高,動脈內膜有明顯的脂質沉積;與模型對照組比較,復方山楂煎劑組動脈粥樣硬化積分有所降低。

心肌梗死是由于心肌持久缺血、缺氧所引起的心肌壞死。心肌梗死組織鏡下觀察可見心肌纖維呈凝固性壞死,根據梗死時間不同,可有中性粒細胞浸潤和肉芽組織生長,大約5周后形成瘢痕組織。Caspases能調節多種生物過程,Caspase-3、9、10具有促凋亡作用,以級聯的方式切割胞內蛋白,最終導致細胞凋亡;Caspase-1、5、11具有促炎作用,可以介導特異性細胞因子的成熟,還參與細胞焦亡。細胞焦亡為細胞炎性壞死,其表現為細胞不斷脹大直至細胞膜破裂,引起細胞內容物釋放,激活強烈炎癥反應的程序性死亡。與細胞凋亡相比,細胞焦亡發生較快,并伴隨大量促炎癥因子的釋放[14]。Caspase-1與動脈粥樣硬化的發生關系密切,炎性細胞在體內高度表達可引起心力衰竭,過度表達還可加重心力衰竭。本研究結果表明,復方山楂煎劑可降低Caspase-1在心肌缺血模型大鼠心肌細胞中的表達,減少炎性因子釋放,最終減輕因心肌缺血導致的心肌損害。表明復方山楂煎劑可通過抗氧化應激、調節動脈內膜脂質沉積、抗細胞焦亡等作用產生對心肌的保護作用。