基于主成分分析和聚類分析的橄欖油中微量元素的統計比較

楊雯懿，陳林，周學忠

1(中南大學 計算機學院，湖南 長沙，410083)2(湖南省中醫藥研究院中藥研究所，湖南 長沙，410013) 3(湖南工學院 材料與化學工程學院，湖南 衡陽，421008)

橄欖油是以油橄欖油為原料經物理壓榨得到的優質植物油，富含不飽和脂肪酸、多酚、角鯊烯以及維生素等營養物質[1]，具有預防糖尿病、心腦血管疾病、抗衰老、防癌等功能[2]，是地中海飲食的重要組成部分，在西方國家享有“液體黃金”之美譽[3]。雖然橄欖油的品質和等級主要依據其有機指標來確定[4]，但其所含無機組分對于橄欖油的食用安全和保質期起重要的作用[5]，同時，橄欖油中無機元素的含量不僅受油橄欖對礦物元素的吸收和預富集特性所控制，而且與油橄欖的產地和生長環境密切相關[6]。因此，通過研究橄欖油中無機元素的種類和含量，并結合數據統計分析表征橄欖油的地域信息，對橄欖油的產地溯源保護和地理標志保護具有重要意義。

目前，植物油樣品的前處理技術主要有干法灰化、濕法消解、微波消解和有機溶劑稀釋等方法[7-8]。干法灰化法和濕法消解法在加熱處理過程會導致部分元素揮發，不能用于揮發性元素的測定；微波消解法樣品消解徹底，但由于消解油脂的特殊性，長時間預消解操作費時，不適合高通量分析[9]；有機溶劑稀釋法避免了復雜煩瑣的消解過程和分析元素的損失，但必須面對有機基質在分析過程中形成的嚴重干擾。在應用于植物油中微量元素的原子光譜測定技術中，電感耦合等離子體串聯質譜(inductively coupled plasma tandem mass spectrometry，ICP-MS/MS)利用特有的串聯質譜和碰撞反應池(collision reaction cell，CRC)系統，幾乎可以消除所有干擾，適合微量以及痕量元素的測定[10-12]。因此，采用有機溶劑稀釋結合ICP-MS/MS能準確測定植物油中的微量元素。

主成分分析是通過對錯綜復雜數據進行降維，篩選能重現的數據信息，將原變量轉換為少數新變量(主成分)的多元統計分析方法，主成分分析能集中典型地表征原變量的數據特征，從而充分反映總體信息[13]。聚類分析是依據觀察對象某些特征加以歸類的數理統計方法[14]。主成分分析和聚類分析已廣泛應用于食品分類和產地溯源的研究[15-18]。本文采用煤油稀釋橄欖油后直接進樣，利用ICP-MS/MS測定其中16種微量元素的含量，并根據不同產地橄欖油中微量元素的含量進行主成分分析和聚類分析，以期為橄欖油的產地溯源保護和地理標志保護提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

18種特級初榨橄欖油樣品(產地分別為意大利4種、希臘4種、西班牙4種、中國6種)購置于京東超市。

1 000 μg/g的Na、K、Ti、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Sr、Cd、Hg、Pb單元素油標，美國Spex CertiPrep公司；1 000 μg/g的Sc、Y、Bi單元素內標，美國Spex CertiPrep公司；高純煤油，國藥集團化學試劑有限公司；99.99%的高純O2、NH3、He，湖南省華中特種氣體有限公司產品。

1.2 儀器及設備

Agilent 8800型電感耦合等離子體串聯質譜儀，美國Agilent公司；配置有自吸式C-flow 200 PFA霧化器，Peltier冷卻雙通道Scott型霧化室，窄口徑(內徑為1.5 mm)進樣炬管，S透鏡，Pt錐。Element XR型扇形磁場電感耦合等離子質譜(sector field inductuvely coupled plasma mass spectormetry，SF-ICP-MS)儀，美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 橄欖油前處理

采用質量稀釋法用煤油將橄欖油樣品進行5倍稀釋后待測，同時采用煤油為空白試劑。

1.3.2 ICP-MS/MS工作參數

ICP-MS/MS調諧優化后的操作條件：射頻功率1 550 W；載氣流速1.08 L/min；輔助氣流速1.08 L/min；補償氣流速0.15 L/min；采樣深度8.0 mm；O2流速0.08 L/min；操作模式MS/MS；反應氣O2、NH3/He(He中混入10%的NH3)；反應氣流速，O20.30 mL/min、NH3/He 3.0 mL/min；八極桿偏置電壓-18 V；動能歧視電壓-8 V；同位素23Na、39K、48Ti、52Cr、55Mn、56Fe、59Co、60Ni、63Cu、66Zn、75As、78Se、88Sr、111Cd、202Hg、208Pb。

1.3.3 橄欖油微量元素的測定

采用煤油將1 000 μg/g的分析元素油標和內標進行稀釋，配制0.00、2.00、10.、50.0、200 μg/kg系列分析元素混合油標，使用標準內標混合“T”型接頭在線加入1 μg/g的Sc、Y、Bi混合內標，在優化的ICP-MS/MS操作條件下進行測定，獲得各元素的校準曲線，同時對空白和樣品進行測定，利用MassHunter工作站軟件計算樣品中分析元素的含量。

1.3.4 統計分析

利用18種橄欖油樣品中16種微量元素的含量組成18×16的原始數據矩陣，應用SPSS 25軟件進行統計分析。將原始數據進行標準化處理，以消除橄欖油中微量元素原始數據之間的量綱和數量級不同對分析結果的影響，使標準化后的數據具有可比性并遵循正態分布規律，從而進行主成分分析和聚類分析。

2 結果與分析

2.1 ICP-MS/MS的分析性能評價

2.1.1 線性關系與檢出限

按實驗條件采用ICP-MS/MS測定系列分析元素混合油標，以分析元素與內標元素的信號強度比值所對應的標準溶液濃度自動進行線性回歸，建立校準曲線，各元素的線性范圍和相關系數見表1。采用所建立的方法對空白(煤油)連續測定10次，計算各元素標準偏差，以3倍標準偏差所對應的濃度為儀器的檢出限(limit of detection，LOD)[19]。由表1可以看出，所有分析元素在具有良好的線性關系，線性相關系數≥0.999 7。各元素儀器的LOD為0.001～1.22 μg/kg。

表1 分析元素的線性關系與檢出限Table 1 Linear relationship and the limit of detection for analytes

2.1.2 方法準確性與精密度

由于缺少橄欖油標準參考物質，本實驗選取實際樣品中加入油標，采用所建立的分析方法對加標樣品平行測定6次，計算各元素的加標回收率和相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)，同時采用SF-ICP-MS對加標樣品進行分析，對2種分析方法的測定結果進行統計學分析，用來評價ICP-MS/MS的準確性和精密度，結果見表2。由表2可以看出，各元素的加標回收率為95.2%～108%，RSD≤5.3%；16種分析元素的加標測定值與采用SF-ICP-MS的加標測定值基本一致，驗證了所建立的方法準確性和精密度好。

表2 加標樣品的分析結果(n=6)Table 2 Results obtained for analytes in spiked sample (n=6)

2.2 橄欖油樣品分析

采用ICP-MS/MS法測定了來自國內外不同產地的18種橄欖油樣品，其中來自意大利4種(樣品編號IT1-4)、希臘4種(樣品編號GR1-4)、西班牙4種(樣品編號ES1-4)、中國6種(樣品編號CN1-6)，測定各橄欖油中的16種微量元素，每個樣品重復測定6次，結果見表3。18種橄欖油中Na、K、Fe、Cr的含量相對較高，而Co、Cd、Hg、Pb的含量相對較低。對照我國橄欖油國家標準GB 23347—2009以及食品中污染物限量國家標準GB 2762—2017[20]，所有橄欖油中的Fe、Cu的含量均低于GB 23347—2009中特級初榨橄欖油的限量值，重金屬元素的含量遠遠低于GB 2762—2017中的限量標準。

表3 不同產地橄欖油中微量元素的含量(已進行了稀釋校正) 單位：μg/kg

2.3 主成分分析

2.3.1 橄欖油中微量元素的適用性檢驗

采用SPSS 25的Bartlett's球狀檢驗對18種橄欖油中的16種微量元素進行適用性檢驗，考察原始數據矩陣中各變量的相關性，當顯著性值(Sig或P)<0.05時，原始數據矩陣中各變量具有相關性，適合主成分分析，反之不適合主成分分析[21]。本實驗檢驗結果表明，原假設原始數據矩陣是單位矩陣時的顯著性值為0.000，拒絕原始數據矩陣中各變量全獨立的原假設，表明18種橄欖油中的16種微量元素之間具有強線性相關性，能應用主成分分析進行研究。

2.3.2 主成分的貢獻率與選擇

采用主成分分析法提取公因子，其特征值和總體方差描述見表4。由表4可以看出，累計方差貢獻率的80.961%來源于前5個主成分，即1個5因子模型可解釋80.961%的實驗數據，包含了18種橄欖油中16種微量元素的大部分信息，并且這5個主成分的特征值均>1，符合累積方差貢獻值大于80%且特征值>1的主成分個數選擇原則[22]。因此，本實驗提取前5個主成分來評判16種微量元素在18種橄欖油中的分布。

表4 主成分分析特征值和總體方差描述Table 4 Principal component analysis characteristics and total variance explained

2.3.3 微量元素的因子分析

根據橄欖油中微量元素的因子分析結果(見表5)，分別建立5個主成分因子(F1、F2、F3、F4、F5)得分模型：

表5 橄欖油中微量元素的因子分析Table 5 Factor analysis of trace elements in olive oil

F1=0.945X1+0.595X2+0.853X3-0.521X4-0.687X5+0.623X6-0.445X7+0.761X8+0.942X9+0.926X10-0.667X11+0.713X12+0.909X13-0.431X14+0.379X15+0.196X16

F2=-0.039X1+0.037X2+0.028X3+0.386X4-0.398X5+0.239X6-0.520X7-0.190X8-0.099X9-0.114X10+0.367X11+0.140X12-0.069X13+0.140X14-0.033X15+0.832X16

F3=0.153X1-0.524X2+0.261X3+0.155X4-0.164X5+0.382X6+0.326X7+0.245X8+0.079X9+0.171X10+0.308X11-0.434X12+0.101X13-0.102X14-0.580X15-0.007X16

F4=0.091X1-0.263X2+0.198X3+0.470X4-0.068X5+0.047X6+0.290X7+0.048X8+0.036X9+0.081X10-0.021X11+0.235X12+0.045X13+0.697X14+0.439X15-0.173X16

F5=0.116X1+0.069X2+0.079X3+0296X4+0.290X5+0.429X6-0.126X7-0.407X8-0.001X9+0.124X10+0.132X11-0.252X12+0.007X13-0.365X14+0.404X15-0.216X16

可以看出，F1在X1、X3、X9、X10、X13有較大的因子載荷值，分別為0.945、0.853、0.942、0.926、0.909，與對應的Na、Ti、Cu、Zn、Sr高度正相關，F2在X16有較大因子荷載值(0.832)，與對應Pb高度正相關，由于F1和F2的累積方差貢獻率(58.392%)大于50%，可確定Na、Ti、Cu、Zn、Sr、Pb是橄欖油的特征元素。

2.4 聚類分析

通過ICP-MS/MS測定得到橄欖油中微量元素含量的原始數據較為離散，不能直觀地比較各元素的相近程度。本實驗采用SPSS 25的系統聚類分析對不同產地橄欖油樣品進行聚類分析。以16種微量元素含量為變量，對數據進行標準處理后，以歐氏距離平方(系統默認)為準則采用組間連接聚類，結果如圖1所示。可以看出，隨著聚類距離的增大，聚類結果也逐漸發生變化。當聚類距離為10時，18種橄欖油聚為兩大類，國內樣品聚為一類，國外樣品聚為一類；當聚類距離為8時，18種橄欖油聚為四大類，國內樣品聚為一類，國外樣品意大利產橄欖油歸為一類，希臘產橄欖油歸為1類，西班牙產橄欖油歸為一類。表明以橄欖油中16種微量元素為變量可以對不同產地的橄欖油進行溯源，有利于橄欖油的產地溯源保護和地理標志保護。

圖1 橄欖中微量元素含量系統聚類Fig.1 Phylogenetic clustering of olive oil based on trace elements

3 結論

利用ICP-MS/MS測定了不同產地橄欖油中16種微量元素Na、K、Ti、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Sr、Cd、Hg、Pb的含量，采用SPSS 25對18種橄欖油中16種微量元素組成的原始數據矩陣進行了主成分分析和聚類分析。橄欖油中的Na、K、Fe、Cr含量相對較高，Co、Cd、Hg、Pb含量相對較低，其余微量元素無明顯規律性。不同產地橄欖油中微量元素的含量具有地域特征，通過聚類分析可以較好地區分橄欖油的產地來源，研究結果為橄欖油的產地判別提供了準確可靠的標記驗證方法。