殼聚糖/功能性自組裝多肽復合支架的制備及神經再生研究

胡 萍，張雙英，李 潔，雷琪琪，張文檸，敖寧建,*

(1.暨南大學生命科學技術學院，廣東 廣州 510632；2.廣東省教育廳生物材料重點實驗室，廣東 廣州 510632)

殼聚糖(CS)因其良好的生物相容性，成為了神經組織工程中重要的生物高分子材料[1-3]。研究表明，以殼聚糖為基底物質構建組織工程支架對神經修復具有獨特的優勢[4-13]，但是單純的殼聚糖支架在水化狀態下不能為細胞提供良好的生長環境，所以常用化學交聯劑對殼聚糖進行改性[9]。京尼平作為一種性能優良的天然生物交聯劑，在交聯過程中產生的毒性遠小于戊二醛，還能減少炎癥的發生[14]。然而，僅用京尼平交聯的殼聚糖支架并不能很好地促進細胞定向生長和分化。趙玉園[15]利用靜電紡絲技術制備的PLLA/ SAP生物支架能為神經干細胞提供更加穩定的生長環境，并且能夠誘導神經軸突的伸長。鑒于此，作者利用天然生物交聯劑京尼平交聯CS和功能性自組裝多肽(F-SAP)，經冷凍干燥制備不同配比的CS/F-SAP復合支架；通過比較復合支架的微觀形貌、孔隙率、力學性能和吸水率確定復合支架的最佳配比；通過研究復合支架對神經干細胞分化的影響探究其對神經再生的作用。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

京尼平、牛血清白蛋白(BSA)，百靈威科技有限公司；殼聚糖、PDL、兔源-GFAP、Alexa Fluor 488-Phalloidi，Sigma-Aldrich公司；DMEM/F12、EGF、BFGF、B27(含VA)、B27(不含VA)、N2、Accutase，GIBCO公司；抗鼠源-Tubulin-β，Bio Legend公司；Alexa Fluor 546二抗，Invitrogen公司；Triton X-100，Amresco公司；含DAPI的熒光保護劑，Electron Microscopy Science公司。

EQIOMOX55型傅立葉紅外光譜儀、ULTRA55型掃描電子顯微鏡、LSM700型激光共聚焦顯微鏡，Carl Zeiss公司；冷凍干燥機，五洲東方科技有限公司。

1.2 CS/F-SAP復合支架的制備

配制20 mg·mL-1的CS溶液(pH=5.5)和10 mg·mL-1的F-SAP溶液(pH=7)，采用化學交聯法制備CS/F-SAP復合支架。將CS溶液與F-SAP溶液分別按體積比3∶1、1∶1、1∶3混合均勻，再將各組混合液與2 mg·mL-1的京尼平溶液按體積比3∶1混合，振蕩均勻，加入24孔板中，冷凍干燥，即得CS/F-SAP復合支架，分別標記為CS/F-SAP-1、CS/F-SAP-2、CS/F-SAP-3。不添加F-SAP溶液，同法制備CS支架作為對照。

1.3 CS/F-SAP復合支架的微觀形貌

將CS/F-SAP復合支架冷凍干燥24 h后，粘附在導電板上并涂金，采用掃描電子顯微鏡觀察其微觀形貌。

1.4 CS/F-SAP復合支架孔隙率的測定

稱量CS/F-SAP復合支架的質量(m0)；將其放入盛滿乙醇的比重瓶中，稱量比重瓶的質量(m1)；再脫氣，加滿乙醇，稱量乙醇和比重瓶的質量(m2)；最后將復合支架取出，稱量剩余乙醇和比重瓶的質量(m3)，按式(1)計算孔隙率：

(1)

1.5 CS/F-SAP復合支架力學性能的測定

將CS/F-SAP復合支架冷凍干燥24 h，利用電子萬能材料試驗機對其進行壓縮，繪制CS/F-SAP復合支架的壓縮應力應變曲線。

1.6 CS/F-SAP復合支架吸水率的測定

稱量CS/F-SAP復合支架的質量(m0)；將其放入PBS緩沖液中浸泡3 min后取出，用濾紙吸去復合支架表面多余的水分后稱量質量(m4)，按式(2)計算吸水率：

(2)

1.7 細胞培養

采用維持培養基將懷孕14.5 d的C57胎鼠鼠腦源神經干細胞原代培養7 d；用Accutase消化神經球，使細胞呈單個狀態，以合適的密度接種到支架表面；再將培養板放回培養箱，采用分化培養基培養7 d。其中培養箱的溫度為37 ℃，CO2濃度為5%。

維持培養基配方：DMEM/F12培養基、1%雙抗、1%谷氨酰胺、2% B27(不含VA)、1% N2、20 ng·mL-1BFGF、0.1%肝素。

分化培養基配方：DMEM/F12培養基、1%FBS、1%雙抗、1% B27(含VA)。

1.8 細胞免疫熒光染色

將在支架中培養7 d后的神經干細胞用多聚甲醛(4%)固定15 min，再用Triton X-100(0.1%)和含有BSA(3%)的PBS緩沖液封閉30 min；用抗鼠源-Tubulin-β標記神經元，兔源-GFAP標記星型膠質細胞；將Alexa Fluor 546(驢抗鼠)和Alexa Fluor 488(驢抗兔)溶解在PBS緩沖液中，常溫避光反應2 h；用DAPI(1∶1000)染色細胞核，避光反應10 min，置于激光共聚焦顯微鏡中觀察。將包被了PDL的玻片作為對照組。

2 結果與討論

2.1 CS/F-SAP復合支架的SEM分析(圖1)

a.CS b.CS/F-SAP-1 c.CS/F-SAP-2 d.CS/F-SAP-3

從圖1可以看出，CS支架和不同配比的CS/F-SAP復合支架均具有多孔結構，說明F-SAP的加入不影響CS支架的多孔結構。這是因為，CS和F-SAP帶有相同的電荷，交聯前彼此分散，無團聚現象。研究[16]表明，材料的多孔結構可以為細胞提供更大的粘附空間。

2.2 CS/F-SAP復合支架的孔隙率(圖2)

圖2 CS/F-SAP復合支架的孔隙率Fig.2 Porosity of CS/F-SAP composite scaffolds

從圖2可以看出，復合支架的孔隙率隨著F-SAP比例的增大逐漸升高，但增幅較小。其中，CS支架的孔隙率為(90±0.98)%，CS/F-SAP-1、CS/F-SAP-2、CS/F-SAP-3復合支架的孔隙率分別為(96±0.75)%、(98±0.50)%、(98±0.58)%。這是因為，隨著CS/F-SAP復合支架中F-SAP比例的增大，CS所占比例減小，使得交聯點的密度減小，導致孔隙率升高。

2.3 CS/F-SAP復合支架的力學性能

CS/F-SAP復合支架的壓縮應力應變曲線如圖3所示。

圖3 CS/F-SAP復合支架的壓縮應力應變曲線Fig.3 Compressive stress-strain curves of CS/F-SAP composite scaffolds

從圖3可以看出，復合支架的力學強度隨著F-SAP比例的增大有所減小，但減幅不大。其中，CS支架的力學強度最好，CS/F-SAP-1復合支架和CS/F-SAP-2復合支架的力學強度適中，CS/F-SAP-3復合支架的力學強度最差。這是因為，隨著CS/F-SAP復合支架中F-SAP比例的增大，CS所占比例減小，使得交聯點的密度減小，導致交聯網絡的機械強度降低。

此外，多孔支架的壓縮應變由材料本身決定。這表明，可以通過改變CS與F-SAP的比例來調節復合支架的機械強度。

2.4 CS/F-SAP復合支架的吸水率(圖4)

圖4 CS/F-SAP復合支架的吸水率Fig.4 Water absorption of CS/F-SAP composite scaffolds

從圖4可以看出，F-SAP在復合支架中的比例對復合支架的吸水率影響較大，復合支架的吸水率隨著F-SAP比例的增大而升高。其中，CS支架的吸水率為(226±1.38)%，CS/F-SAP-1、CS/F-SAP-2、CS/F-SAP-3復合支架的吸水率分別為(236±1.75)%、(291±1.59)%、(305±1.73)%。表明，CS/F-SAP-2復合支架和CS/F-SAP-3復合支架的吸水率都較高。這是因為，隨著CS/F-SAP復合支架中F-SAP比例的增大，CS所占比例減小，三維網絡交聯點的密度也隨之減小，使得水分子更容易進入支架網絡結構，導致吸水率升高。

綜上，CS/F-SAP-2復合支架和CS/F-SAP-3復合支架的孔隙率和吸水率都較高，但是CS/F-SAP-3復合支架交聯點的密度較小，機械強度較低。因此，選擇CS/F-SAP-2復合支架為最佳材料，即制備CS/F-SAP復合支架最佳CS溶液與F-SAP溶液的體積比為1∶1。

2.5 CS/F-SAP復合支架對神經干細胞分化的影響

神經干細胞具有多向分化的功能，可以分化為神經元、星型膠質細胞和少突膠質細胞[17]，具有可塑性強、遷移率高和免疫原性低等特點。在神經損傷修復過程中，神經元和星型膠質細胞相互調控，兩者以正反饋的方式促進神經修復[18]。研究[19]表明，神經損失后7 d，星型膠質細胞數量約增加8%。在免疫熒光染色的研究中，顯示了神經元和軸突的密度。神經干細胞在支架中培養7 d后的免疫熒光照片如圖5所示。

a.CS/F-SAP-2 b.CS c.PDL

從圖5可以看出，CS/F-SAP-2復合支架相比于其它兩組支架，對神經干細胞的分化效果更好，神經元和軸突的密度更大。表明，CS/F-SAP-2復合支架可以有效改善神經的微結構修復。此外，通過計數軟件Image-J計算神經元和星型膠質細胞占細胞總數的百分比，結果如圖6所示。

a.神經元分化比例 b.星型膠質細胞分化比例

從圖6a可以看出，相比于其它兩組，CS/F-SAP-2復合支架中神經元分化比例最大，說明CS/F-SAP-2復合支架有利于神經干細胞向神經元方向分化。同時，從圖6b可以看出，相比于其它兩組，CS/F-SAP-2復合支架中星型膠質細胞分化比例最小，也證明了CS/F-SAP-2復合支架能夠抑制星型膠質細胞的分化，促進神經干細胞更多地向神經元方向分化，有利于神經再生。

3 結論

利用天然生物交聯劑京尼平交聯CS和F-SAP，經冷凍干燥制備了不同配比的CS/F-SAP復合支架，通過比較復合支架的微觀形貌、孔隙率、力學性能和吸水率確定制備復合支架的最佳配比：20 mg·mL-1CS溶液與10 mg·mL-1F-SAP溶液的體積比為1∶1。最佳配比下制備的CS/F-SAP復合支架能夠促進神經干細胞向神經元方向分化，促進神經再生。