陜產長春七揮發油提取工藝優化及抗氧化活性研究

侯敏娜，侯少平，許海燕，劉艷紅，王 珊，賴普輝

(陜西國際商貿學院，陜西 咸陽 712046)

長春七，又名長蟲七，為傘形科植物巖風[Libanotisbuchtorimensis(Fisch.)Dc.]的根，在《全國中草藥匯編》《秦嶺植物志》《陜西中草藥名錄》中都有記載，是陜西“太白七藥”中八大金剛之一。長春七野生于秦嶺山區，甘肅、四川也有分布，以太白山產長春七質地最優，其性甘、溫，味苦，具有疏風散寒、祛風除濕、活絡止痛的功效，主要用于風寒感冒、周身疼痛、關節腫脹、跌打損傷等疾病的治療。長春七主要含有香豆素類、萜類、揮發油及酯類等多種化學成分[1-3]?，F代藥理研究表明，長春七具有鎮痛、抗炎、抗菌等活性[4-5]，而國內外大部分文獻僅報道了其揮發油抑菌作用。經查閱相關文獻，植物中揮發油具有一定的抗氧化作用。鑒于此，作者以揮發油提取率為評價指標，采用單因素實驗和響應面法實驗優化陜產長春七揮發油的超聲提取工藝，并考察長春七揮發油對DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力，評價其抗氧化活性。擬為合理開發利用太白山區這一特有藥用資源提供理論基礎。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

長春七，2018年采自于陜西省寶雞市眉縣，經陜西國際商貿學院中藥教研室雷國蓮教授鑒定為傘形科植物巖風[Libanotisbuchtorimensis(Fisch.)Dc.]的根。

乙醚，天津天力化學試劑有限公司；正己烷，廣東省化學試劑工程技術研究開發中心；石油醚、乙醇，天津河東區紅巖試劑廠；無水硫酸鈉，天津盛奧化學試劑有限公司；所用試劑均為分析純。

KQ5200DE型臺式數控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)型循環水式多用真空泵，李倉區恒通興達儀器儀表商行；RE-52型系列旋轉蒸發儀，鞏義瑞力儀器設備有限公司；KQ-A型玻璃儀器氣流烘干器，北京中興偉業儀器有限公司；TU-1810型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 長春七揮發油的提取

將長春七切碎，在40 ℃充分干燥后，粉碎過80目篩。準確稱取4份長春七粉末各1.000 0 g，分別置于編號為A、B、C、D的錐形瓶中，依次分別加入60 mL的乙醚、石油醚、正己烷、無水乙醇，搖勻，在一定條件下超聲處理一定時間，加入一定量的無水硫酸鈉(以不產生結晶為度)，過濾、濃縮、低溫干燥、稱重，按式(1)計算揮發油提取率[6-9]：

(1)

式中：m1為干燥至恒重后的蒸發皿與長春七揮發油的總質量，g；m2為干燥至恒重后蒸發皿的質量，g；m為干燥的長春七粉末質量，g。

1.3 單因素實驗[7，9]

1.3.1 提取溶劑對長春七揮發油提取率的影響

在超聲功率為160 W、超聲溫度為25 ℃、料液比為1∶60(g∶mL，下同)、超聲時間為20 min的條件下，考察不同提取溶劑(乙醚、石油醚、正己烷、無水乙醇)對長春七揮發油提取率的影響。

1.3.2 料液比對長春七揮發油提取率的影響

在超聲功率為160 W、超聲溫度為25 ℃、超聲時間為20 min、提取溶劑為乙醚的條件下，考察不同料液比(1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70)對長春七揮發油提取率的影響。

1.3.3 超聲時間對長春七揮發油提取率的影響

在超聲功率為160 W、超聲溫度為25 ℃、料液比為1∶50、提取溶劑為乙醚的條件下，考察不同超聲時間(10 min、15 min、20 min、25 min、30 min)對長春七揮發油提取率的影響。

1.3.4 超聲溫度對長春七揮發油提取率的影響

在超聲功率為160 W、超聲時間為20 min、料液比為1∶50、提取溶劑為乙醚的條件下，考察不同超聲溫度(15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃)對長春七揮發油提取率的影響。

1.4 響應面法實驗

在單因素實驗的基礎上，選取對長春七揮發油提取率影響顯著的3個因素料液比(X1)、超聲時間(X2)和超聲溫度(X3)，采用Box-Behnken中心組合方法設計3個水平進行響應面法實驗，因素與水平見表1。

表1 響應面法實驗的因素與水平

1.5 長春七揮發油的抗氧化活性研究[10-13]

1.5.1 DPPH自由基清除活性的測定

1.5.1.1 溶液的配制

DPPH自由基溶液的配制：精密稱量2 mg DPPH自由基置于100 mL容量瓶中，用無水乙醇定容，得濃度為0.02 mg·mL-1的DPPH自由基溶液，避光保存。

長春七揮發油溶液的配制：分別準確稱取長春七揮發油0.08 g、0.10 g、0.12 g、0.14 g、0.16 g、0.18 g，用無水乙醇定容，得濃度分別為0.8 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、1.2 mg·mL-1、1.4 mg·mL-1、1.6 mg·mL-1、1.8 mg·mL-1的長春七揮發油溶液，備用。

1.5.1.2 長春七揮發油對DPPH自由基清除活性的測定

取2 mL不同濃度的長春七揮發油溶液，分別注入2 mL DPPH自由基溶液，振蕩搖勻后于避光處靜置30 min，測定517 nm處吸光度。以無水乙醇作為空白對照。按式(2)計算DPPH自由基清除率：

(2)

式中：A0為2 mL DPPH+2 mL無水乙醇的吸光度；A1為2 mL DPPH+2 mL樣品溶液的吸光度；A2為2 mL無水乙醇+2 mL樣品溶液的吸光度。

1.5.2 ABTS自由基清除活性的測定

1.5.2.1 溶液的配制

ABTS+溶液的配制：準確稱取K2S2O80.013 4 g，加入適量蒸餾水，超聲使其充分溶解，定容，配成濃度為2.45 mmol·L-1的K2S2O8水溶液；準確稱取ABTS 0.038 4 g，加入適量純水，超聲使其充分溶解，定容，配成濃度為7 mmol·L-1的ABTS水溶液；然后將上述兩種溶液混合反應，避光放置12～14 h后得ABTS+母液。使用時將ABTS+母液用無水乙醇稀釋，使其在734 nm處吸光度在0.7左右。

長春七揮發油溶液的配制：分別準確稱取長春七揮發油0.10 g、0.15 g、0.20 g、0.25 g、0.30 g、0.35 g，用無水乙醇定容，得濃度分別為1.0 mg·mL-1、1.5 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1、2.5 mg·mL-1、3.0 mg·mL-1、3.5 mg·mL-1的長春七揮發油溶液，備用。

1.5.2.2 長春七揮發油對ABTS自由基清除活性的測定

取2 mL不同濃度的長春七揮發油溶液，分別加入2 mL稀釋后的ABTS+溶液，搖勻，避光保存30 min，測定734 nm處的吸光度。以無水乙醇作為空白對照。按式(3)計算ABTS自由基清除率：

(3)

式中：A3為2 mL ABTS++2 mL無水乙醇的吸光度;A4為2 mL ABTS++2 mL樣品溶液的吸光度；A5為2 mL無水乙醇+2 mL樣品溶液的吸光度。

1.6 數據處理

采用Design-Expert 8.0.6軟件對數據進行處理分析。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 提取溶劑對長春七揮發油提取率的影響(圖1)

圖1 提取溶劑對長春七揮發油提取率的影響Fig.1 Effect of extraction solvent on extraction rate of volatile oil from Libanotis buchtorimensis

由圖1可知，以乙醚、石油醚、正己烷、無水乙醇為提取溶劑時，長春七揮發油提取率分別為14.87%、14.28%、13.00%和10.39%，其中提取溶劑為乙醚時，提取率最高。故選擇乙醚為提取溶劑。

2.1.2 料液比對長春七揮發油提取率的影響(圖2)

圖2 料液比對長春七揮發油提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of volatile oil from Libanotis buchtorimensis

由圖2可知，隨著料液比的減小，即提取溶劑用量的增加，長春七揮發油提取率呈先升高后降低的趨勢；當料液比為1∶50時，長春七揮發油提取率最高。這可能是由于，揮發油在一定料液比范圍內趨于飽和，同時當溶劑用量過多時，經加熱沸騰，原料和揮發油會出現沾壁現象，從而降低提取率。故選擇料液比為1∶50。

2.1.3 超聲時間對長春七揮發油提取率的影響(圖3)

圖3 超聲時間對長春七揮發油提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on extraction rate of volatile oil from Libanotis buchtorimensis

由圖3可知，當超聲時間為20 min時，長春七揮發油提取率最高；繼續延長超聲時間，長春七揮發油提取率明顯下降。這可能是由于，當超聲時間較長時，長春七揮發油中的有效成分揮發或者分解。故選擇超聲時間為20 min。

2.1.4 超聲溫度對長春七揮發油提取率的影響(圖4)

圖4 超聲溫度對長春七揮發油提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on extraction rate of volatile oil from Libanotis buchtorimensis

由圖4可知，隨著超聲溫度的升高，長春七揮發油提取率呈先升高后降低的趨勢；當超聲溫度為25 ℃時，長春七揮發油提取率最高。這可能是由于，超聲溫度過高，會使長春七揮發油中有效成分揮發或者分解，導致提取率降低。故選擇超聲溫度為25 ℃。

2.2 響應面法實驗結果

2.2.1 二次回歸模型建立和方差分析

以長春七揮發油提取率為響應值，在單因素實驗的基礎上，按照響應面Box-Behnken的設計原理，設計17組實驗，結果見表2。

表2 響應面法實驗設計及結果

對該模型進行方差分析，結果見表3。

由表3可知，回歸模型的R2=0.9625，表明長春七揮發油提取率的實驗值與預測值有較好的擬合度。然而，通過對比其各因素影響程度可知，料液比(X1)的一次項、二次項較顯著，超聲時間(X2)的二次項極顯著，說明料液比和超聲時間對長春七揮發油提取率的影響較大。失擬項不顯著，說明可以使用這些因素對長春七揮發油提取率進行初步預測以及分析。同時由F值可知，各因素對長春七揮發油提取率影響的大小順序為：料液比>超聲時間>超聲溫度。

2.2.2 交互作用分析

表3 響應面回歸模型的方差分析

根據模型繪制響應面圖，結果見圖5。

由圖5a可知，料液比與超聲時間的曲面均有坡度，且超聲時間的曲面坡度更陡，表示超聲時間的二次項對長春七揮發油提取率有明顯的影響，而料液比對其的影響略小。由圖5b可知，超聲時間的坡面比超聲溫度的坡面陡，說明超聲時間的二次項對長春七揮發油提取率的影響大于超聲溫度。由圖5c可知，料液比的曲面坡度較陡，說明料液比的二次項對長春七揮發油提取率的影響比較顯著。由圖5得到因素的合理水平范圍為：料液比1∶(50～60)，超聲時間20～25 min，超聲溫度25～30 ℃。

求導得到長春七揮發油最佳提取工藝為：料液比1∶52.73、超聲時間20.37 min、超聲溫度26.13 ℃，在此提取條件下，長春七揮發油提取率的理論值為13.641 6%。綜合考慮，將各因素修正為：料液比1∶53、超聲時間20 min、超聲溫度26 ℃。在此條件下，平行進行3次放大實驗，經計算可得揮發油提取率為13.639 2%，與理論值差值為0.002 4%，說明此方法可行，可用于長春七揮發油的提取。

圖5 各因素交互作用的響應面圖Fig.5 Response surface map for interaction between each factors

2.3 長春七揮發油抗氧化實驗結果

2.3.1 長春七揮發油清除DPPH自由基能力(圖6)

圖6 長春七揮發油對DPPH自由基的清除率Fig.6 Scavenging rate of DPPH free radicals by Libanotis buchtorimensis

由圖6可知，DPPH自由基清除率隨長春七揮發油溶液濃度的增大呈升高趨勢，表明長春七揮發油對DPPH自由基有清除效果，其具有一定程度的抗氧化活性。在0.8～1.8 mg·mL-1濃度范圍內，清除率與濃度呈線性關系(R2>0.98)，擬合效果較好，兩變量相關性強。在此條件下，長春七揮發油清除DPPH自由基線性范圍在1.4～1.8 mg·mL-1為最佳。

2.3.2 長春七揮發油清除ABTS自由基能力(圖7)

由圖7可知，ABTS自由基清除率隨長春七揮發油溶液濃度的增大呈升高趨勢，表明長春七揮發油對ABTS自由基具有一定的清除能力，其具有一定程度的抗氧化活性。在1.0～3.5 mg·mL-1濃度范圍內，清除率與濃度呈線性關系(R2>0.99)，擬合度較高，

圖7 長春七揮發油對ABTS自由基的清除率Fig.7 Scavenging rate of ABTS free radicals by Libanotisbuchtorimensis

且兩變量相關性較強。在此條件下，長春七揮發油清除ABTS自由基線性范圍在2.5～3.5 mg·mL-1為最佳。

3 結論

以揮發油提取率為評價指標，采用單因素實驗和響應面法實驗優化陜產長春七揮發油的超聲提取工藝，并考察了長春七揮發油對DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力。確定長春七揮發油的最佳提取工藝為：以乙醚為提取溶劑、料液比1∶53 (g∶mL)、超聲時間20 min、超聲溫度26 ℃。在此提取工藝條件下， 經3次平行放大實驗驗證，得長春七揮發油提取率為13.639 2%，與理論值(13.641 6%)較為接近，說明此方法具有可行性和合理性。長春七揮發油在一定的濃度范圍內，對DPPH自由基和ABTS自由基的清除率隨其濃度的增大而升高，且呈一定的量效關系；長春七揮發油清除DPPH自由基線性范圍在1.4～1.8 mg·mL-1為最佳，長春七揮發油清除ABTS自由基線性范圍在2.5～3.5 mg·mL-1為最佳。該研究為進一步有效開發利用陜西“太白七藥”提供了一定的理論基礎。