小麥抗病相關基因 TaTGA2.2在小麥-條銹菌互作中的表達分析及功能研究

郭雙元，任惠文，張艷琴，馮傳欣，馮 浩，王曉杰，康振生，張新梅

(1. 西北農林科技大學生命科學學院/旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌712100； 2. 西北農林科技大學植物保護學院/旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌712100)

轉錄因子在生物和非生物脅迫信號通路中發揮重要作用[1]。堿性亮氨酸拉鏈蛋白(basic leucine zipper，bZIP)是真核生物轉錄因子中最大、最保守的類型之一[2]，不僅參與植物的生長發育過程，也參與生物和非生物脅迫的響應，如干旱、高鹽、高滲以及病原菌的防御[3-4]。水楊酸(SA)作為一種植物激素，是引起系統獲得性抗性(SAR)的免疫信號。病程相關基因非表達子(non-expressor of pathogenesis-related genes 1，NPR1)在擬南芥突變體篩選中首次被發現，是SA的受體，與SA有很高的親和力[5]。病原菌侵染植物后，植物體內的SA含量會迅速提高，同時以多聚體形式存在的NPR1蛋白會轉變為具有生物活性的單體形式，并轉運至細胞核內與bZIP類轉錄因子中的TGA亞家族相互作用，從而調節防御基因的表達，提高植物的抗病能力[6-7]。AtTGA2、AtTGA3和AtTGA5是擬南芥bZIP 轉錄因子TGA/OBF亞家族中的三個成員，研究發現這三個成員均和NPR1緊密結合[8-10]。煙草TGA2.1/TGA2.2及水稻TGA2.1/TGA2.2/TGA2.3等多個TGA轉錄因子也均能與擬南芥NPR1相互作用，說明在不同物種間NPR1-TGA間的相互作用是高度保守的[9-10]。

目前，小麥中bZIP轉錄因子已被廣泛研究，如在擬南芥中過表達TabZIP基因可增強對鹽、干旱、高溫和氧化脅迫的耐受力[2]；過表達TabZIP174基因可提高擬南芥種子萌發率，且參與植物對干旱脅迫的調節[11]。此外，在小麥條銹病菌(Pucciniastriiformisf. sp.tritici，Pst)的脅迫下，抗病植株中SA受體TabZIP在非親和組合中被快速誘導表達，表現為正調節作用[7]。而易感病小麥在接種赤霉菌后，bZIP 超級家族蛋白Ta_S12983212表現出明顯的負調節作用[12]。以上研究結果均表明，bZIP轉錄因子在植物響應生物及非生物脅迫方面發揮著重要的調節作用。

bZIP轉錄因子在小麥響應條銹菌脅迫的調控過程中起著至關重要的作用，但目前具體的機理尚不明確。本研究通過篩選小麥-條銹菌互作的小麥cDNA文庫，得到了一個編碼bZIP類轉錄因子的TaTGA2.2基因，并利用實時熒光定量PCR技術分析了條銹菌、激素和非生物脅迫處理后小麥TaTGA2.2基因的表達變化。在此基礎上，本研究運用酵母系統驗證 TaTGA2.2的轉錄激活活性，在擬南芥原生質體中進行TaTGA2.2的亞細胞定位，以及利用病毒誘導的基因沉默技術(VIGS)初步分析TaTGA2.2基因在小麥與條銹菌互作過程中的功能，以期深入解析小麥與條銹菌互作的分子機理，為合理選育及利用抗病品種提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試小麥品種為水源 11，小麥條銹菌為非親和生理小種CYR23和親和生理小種CYR31。均由西北農林科技大學植物保護學院提供。

將小麥播種后于光照培養箱中培養(溫度 16 ℃，光照強度 6 000 lx，光照時間 14 h)，待幼苗長至一葉一心期，參照康振生等[13]的方法接種條銹菌，分別采集0、12、24、48、72和 120 h 的小麥葉片用液氮冷凍后保存于-80 ℃冰箱備用。

激素處理：對一葉一心期的小麥幼苗分別噴施溶于0.1%(v/v)乙醇的2 mM的水楊酸(SA)，100 mM的茉莉酮酸酯(JA)，100 mM的乙烯(ET)以及100 mM的脫落酸(ABA)，噴施0.1%(v/v)乙醇作為對照[14]，分別采集0、2、6、12、24和48 h樣品于-80 ℃備用。

非生物脅迫處理：小麥幼苗根部浸泡在20% PEG 4000以及200 mM NaCl的水溶液中分別進行干旱和高鹽處理；用無菌的刀片劃傷葉片進行傷處理；小麥幼苗放置在12 h光周期的生長室進行4 ℃低溫處理，樣品分別在處理0、2、6、12和24 h后采取并存放于-80 ℃備用。

1.2 RNA 的提取與 cDNA 的合成

采用 Biozol 試劑(BioFlux)提取各個取樣時間點接種條銹菌的小麥葉片總RNA，cDNA第一鏈的合成按照Invitrogen公司的M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒操作說明書進行，反轉錄引物采用oligod(T)18。

1.3 TaTGA2.2基因的克隆

從本實驗室構建的水源 11與條銹菌CYR23以及CYR31互作的小麥cDNA文庫，從中篩選小麥TaTGA2.2基因的EST序列，并結合實驗室現有的數據和NCBI等公共數據庫，通過電子克隆得到目標序列。利用軟件Primer Premier 5.0在序列兩端設計擴增引物TaTGA2.2-F/TaTGA2.2-R(表1)。以1.2中反轉錄得到的cDNA為模板進行PCR擴增，PCR擴增體系(40 μL)為： Prime STAR Max DNA Polymerase(Takara，Dalian，China)20 μL，上下游引物各 1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 17 μL。PCR擴增程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，36個循環；72 ℃延伸 6 min，16 ℃保存。目標基因膠回收后將其克隆到T-Simple載體上，并進行雙向測序。

M：DL2000 標準分子量DNA；P：PCR擴增產物。

1.4 序列分析

將克隆得到的測序序列在NCBI網站上運用BLAST搜索工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對NR(Non-Redundant)數據庫進行搜索，進行同源性分析；用ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)進行開放閱讀框查找；用Premier 5.0將ORF序列翻譯成氨基酸序列；使用InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)預測保守結構域或功能域；使用DNAMAN對目的基因氨基酸序列與其他植物的TGA家族轉錄因子進行序列比對；運用MEGA 5.1軟件構建TaTGA2.2與其他bZIP家族成員的系統進化樹。

1.5 表達模式分析

根據TaTGA2.2序列設計特異定量引物，選擇小麥延伸因子TaEF-1α(GenBank accession number:Q03033)作為內參基因，具體引物序列參照表1。以合成的各個處理樣品的cDNA為模板，使用定量儀Bio-Rad CFX96進行實時定量PCR分析。實時熒光定量PCR參照 Guo等[15]的方法。每個處理進行3次生物學重復，根據Ct值求平均值，利用2-△△Ct法[16]計算目標基因的相對表達量。

1.6 亞細胞定位

構建TaTGA2.2與GFP融合表達載體：根據p16318hGFP表達載體的圖譜以及TaTGA2.2基因序列選擇Hind III、BamH I酶切位點，利用Primer Premier 5.0設計擴增去掉終止密碼子的ORF序列的引物，并在上、下游引物上分別引進Hind III、BamH I酶切位點(引物序列參見附表1)。以cDNA為模板，對目的基因進行片段擴增，將正確的擴增片段進行回收和載體構建，然后對構建好的載體進行測序驗證。使用Hind III和BamH I對測序正確的載體以及p16318hGFP載體進行雙酶切，分別回收目的產物。將目的基因回收產物以及載體回收產物使用T4 DNA連接酶進行連接，轉化大腸桿菌并送測序。

將構建成功的融合載體轉化擬南芥原生質體進行瞬時表達分析，觀察TaTGA2.2在細胞中的定位情況。原生質體的制備及轉化方法參照Ahmed等[17]的方法。

1.7 酵母自激活驗證

本實驗在前期研究基礎上，通過InterProScan保守結構域分析，推測TaTGA2.2的轉錄激活區域位于N端前46個氨基酸。為了驗證此推測，本研究根據TaTGA2.2基因序列設計引物，并引進NdeI和BamH I 限制性酶切位點(引物序列參見表1)，將截去N端1～46個氨基酸的TaTGA2.247-334以及TaTGA2.2全長TaTGA2.21-334構建到酵母表達載體pGBKT7 上(具體方法同1.6)，獲得pGBKT7-TaTGA 2.247-334和pGBKT7-TaTGA2.21-334重組質粒。將獲得的重組質粒以及陰性對照pGBKT7空載體分別轉入酵母菌株AH109中(上海唯地生物技術有限公司)，具體轉化方法參照唯地公司產品說明書。將轉化產物涂布于SD/-Trp(Takara，Dalian，China)固體培養基上，30 ℃倒置培養。 2 d后，分別挑取上述SD/-Trp平板上的單克隆至SD/-Trp和SD/-Trp-His-Ade/X-α-gal平板上，30 ℃倒置培養3～4 d，觀察菌落的生長情況以及顏色的變化。

表1 試驗所用引物序列Table 1 Primer sequences used in experiments

1.8 大麥條紋花葉病毒(Barley stripe mosaic virus，BSMV)介導的 TaTGA2.2基因沉默

根據TaTGA2.2基因序列分別設計擴增5′非翻譯區以及部分編碼區和3′非翻譯區以及部分編碼區兩個區域的特異引物(引物序列參見表1)，上下游引物分別引進PacI和NotI酶切位點，用目標片段替換γ-PDS-as陽性對照載體中PDS片段，構建γ-TaTGA2.2-1as和γ-TaTGA2.2-2as兩個載體。用MluI酶切BSMV-α、γ載體，用SpeI酶切BSMV-β載體，用BssH II酶切γ-PDS-as、γ-TaTGA2.2-1as和γ-TaTGA2.2-2as載體，并膠回收純化。以線性化產物為模板使用RiboMAXTM Large Scale RNA Production Systems-T7 試劑盒(Promega,美國)進行體外轉錄。

取α、β各0.5 μL分別與0.5 μL的γ、γ-PDS-as、γ-gene、γ-TaTGA2.2-1as和γ-TaTGA2.2-2as按 1∶1∶1 混合，再加8.5 μL FES buffer混勻后對三葉期小麥的第二葉進行摩擦接種。具體病毒接種步驟參照Yin等[18]的方法。摩擦FES 緩沖液作為陰性對照，γ-PDS-as作為陽性對照。接種后置于16/8 h光暗周期，25 ℃左右進行培養，定期觀察接種γ-PDS-as小麥葉片的漂白以及病毒癥狀。根據漂白表型出現時間 (12 d左右)，在小麥的第4葉接種條銹菌CYR23或CYR31，接種方法參照康振生等[13]的方法。接種后0、24、48和120 h采取樣品用于沉默效率檢測及相關基因的表達量分析，在接種后14 d左右觀察表型。

2 結果與分析

2.1 TaTGA2.2基因的克隆結果

通過PCR擴增得到一條1 000 bp左右的產物(圖1)，利用ORF Finder對克隆測序后的序列進行開放閱讀框(ORF)查找，發現其具有1 005 bp 的ORF，編碼334個氨基酸。在NCBI網站上進行Blastx搜索分析，結果顯示TaTGA2.2蛋白與一粒小麥(Triticummonococcum)TGA蛋白(GeneBank：AGH18703.1)同源性高達99%，同時與二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)TGA2類轉錄因子(GeneBank：XP_010228695.1)、水稻(Oryzasativa)bZIP轉錄因子(GeneBank：BAB72061.1)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)TGA轉錄因子(GeneBank：XP_003627926.1)等也高度同源。

TaTGA2.2、AtTGA2.2、TmTGA、OsbZIP和BdTGA2.2分別來源于普通小麥，山羊草、一粒小麥、水稻和二穗短柄草。

圖3 TaTGA2.2 進化樹分析

2.2 TaTGA2.2基因的序列分析

TaTGA2.2基因編碼334個氨基酸，用Compute pI/MW對編碼蛋白分析，發現其分子量為37.25 KDa，等電點為7.87；利用InterProScan對保守結構域進行預測，發現該蛋白具有一個bZIP保守結構域及一個轉錄因子TGA類似結構域。利用DNAMAN多序列分析顯示， TaTGA2.2氨基酸序列與其他物種的TGA氨基酸序列之間具有很高的同源性，且都含有bZIP保守結構域(圖2)。系統進化樹分析顯示，TaTGA2.2與一粒小麥(AGH18703.1)、水稻(BAB72061.1)和玉米(XP_008658211.1)等單子葉植物中TGA處于同一大分支，其中與一粒小麥的親緣關系最近，二穗短柄草、玉米次之(圖3)。為了比較TaTGA2.2與不同類型的TGA家族轉錄因子之間的進化關系，選擇9個擬南芥TGA家族轉錄因子構建進化樹，結果顯示TaTGA2.2與AtTGA2/5/6(Clade II)屬于同一進化枝(圖4)。

圖4 TaTGA2.2蛋白與9個擬南芥TGA蛋白的同源性分析

2.3 TaTGA2.2的表達模式

接種條銹菌后TaTGA2.2的表達水平如表2所示。在非親和體系中TaTGA2.2在24 h顯著上調表達，大約是對照表達量的9倍，之后開始下降，在120 h恢復到基礎表達水平。親和體系中，TaTGA2.2的表達趨勢與非親和體系基本一致，但整體表達水平較低。以上結果表明，TaTGA2.2受條銹菌誘導表達，并且可能在小麥抗條銹菌過程中發揮一定作用。

表2 條銹菌誘導下 TaTGA2.2的表達量Table 2 Relative expression of TaTGA2.2 induced by Pst

從表3可知，SA處理2 h和6 h后TaTGA2.2的表達量顯著上調，之后表達量降至基礎水平；ABA處理6 h后也顯著上調；JA和ET對TaTGA2.2表達量的影響不大。表明TaTGA2.2基因可能參與SA和ABA相關信號途徑。

表3 TaTGA2.2在激素處理后的相對表達量Table 3 Relative expression of TaTGA2.2 after hormone treatments

從表4可知，TaTGA2.2的表達量在20%PEG 400處理后12 h和24 h顯著上調；200 mmol·L-1NaCl處理6 h后也有一定程度的上調，但不顯著；劃傷以及4 ℃低溫處理后其表達量則沒有明顯變化。表明TaTGA2.2基因可能通過提高其表達量來響應干旱脅迫。

表4 TaTGA2.2在脅迫處理后的相對表達量Table 4 Relative expression of TaTGA2.2 after stress treatments

2.4 TaTGA2.2蛋白的亞細胞定位

TaTGA2.2與GFP的融合表達載體以及空載體對照同時轉化擬南芥原生質體，通過Olympus BX-51熒光顯微鏡觀察發現，TaTGA2.2-GFP融合蛋白定位于細胞核中，而對照組GFP分布于整個細胞中(圖5)。

2.5 TaTGA2.2的酶母自激活驗證結果

為了檢測TaTGA2.2的轉錄激活活性，將融合質粒pGBKT7-TaTGA2.247-334和pGBKT7-TaTGA2.21-334以及陰性對照pGBKT7空載分別轉入酵母菌株AH109中。轉化后的菌株在SD/-Trp缺陷培養基上都生長良好，表明三個重組質粒都成功轉入酵母中，然而只有轉入pGBKT7-TaTGA2.21-334的菌株才能在SD/-Trp-His-Ade缺陷培養基上正常生長，并且轉入pGBKT7-TaTGA2.21-334的菌株在含有X-α-gal的SD/-Trp-His-Ade的培養基上變成藍色(圖6)，表明TaTGA2.2能夠激活His等報告基因的表達。以上結果表明，TaTGA2.2具有轉錄激活活性，并且轉錄激活區域位于N端前46個氨基酸序列中。

A：轉化菌株在SD/-Trp培養基上的生長情況；B：轉化菌株在SD/-Trp-His-Ade培養基上的生長情況；C：轉化菌株在含有X-α-gal的SD/-Trp-His-Ade培養基上的生長情況；D：指示相應檢測載體。

2.6 TaTGA2.2基因沉默后的表型及分析

為了進一步分析TaTGA2.2的功能，借助條銹菌 CYR23 與小麥水源 11的非親和互作體系及CYR31 與小麥水源 11的親和互作體系，進行了病毒介導的VIGS試驗。在摩擦接種空病毒BMSV:γ以及重組病毒BMSV:TaTGA2.2-1as和BMSV:TaTGA2.2-2as 12 d后，葉片均出現輕度退綠、花斑癥狀，而接種BMSV:PDS-as的葉片出現明顯的漂白現象(圖7-A)。對沉默的植株、FES處理以及接空病毒的對照組植株分別接種條銹菌CYR23和CYR31兩個生理小種，14 d后進行表型觀察(圖7-B)，發現在親和組合中，對照組和試驗組均大量產孢，產孢數量無明顯差異；在非親和組合中，對照組和實驗組均出現典型的過敏性壞死，表型上無明顯差異。

A：接種空病毒BMSV:γ、重組病毒BMSV: TaTGA2.2-1as和BMSV: TaTGA2.2-2as以及BMSV:PDS 9 d后的病毒癥狀；B：沉默葉片接種條銹菌CRY23和CYR31的表型。

為確定目的基因的沉默效率，在接種0、24、48和120 h后取樣，利用qRT-PCR技術進行表達量分析，結果顯示TaTGA2.2的表達受到顯著抑制，沉默效率在60%～80%之間(圖8)。同時檢測可能與TaTGA2.2發揮功能相關基因 (NPR1、PR1、PR2以及PR5)的表達水平，發現TaTGA2.2沉默后，與對照組相比NPR1在120 h顯著上調，而PR1、PR2以及PR5的表達水平在沉默前后均無明顯變化(圖9)。

*表示與對照組相比差異顯著。

*表示與對照組相比差異顯著。

3 討 論

bZIP類轉錄因子是許多植物發育和生理過程的主要調節因子，包括胚的形態發育、種子的形成、非生物以及生物脅迫響應等[19]。bZIP基因表達模式的調整和活性的改變通常會導致各種信號途徑以及不同生理過程調控網絡的激活[20]。由TGA組成的一類bZIP轉錄因子作為SA信號的調控因子參與植物對生物脅迫的響應應答[21]。

本研究克隆得到一個小麥基因TaTGA2.2，編碼bZIP類轉錄因子。通過同源性比對以及結構域預測，發現該序列包含典型的bZIP保守結構域和TGA轉錄因子類似結構域，據此推測TaTGA2.2為小麥TGA家族bZIP轉錄因子。典型的轉錄因子具有核定位信號(NLS)及轉錄調控區[22]，利用擬南芥原生質體亞細胞定位試驗證明TaTGA2.2定位于細胞核，同時利用酵母實驗表明 TaTGA2.2的N端具有轉錄激活活性。以上結果表明TaTGA2.2是一個小麥TGA家族轉錄因子，在植物細胞核中作為轉錄激活因子發揮功能。

植物通過調整bZIP基因的表達模式激活不同的信號通路，從而調節不同的生理過程[20]。本研究對TaTGA2.2基因在小麥與條銹菌互作中的表達模式進行了分析，發現TaTGA2.2在非親和互作中表達量明顯上調，與TabZIP1在小麥與條銹菌非親和互作中表達類似[23]。因此推測TaTGA2.2可能參與調控小麥對條銹菌的防御反應。另外，植物激素介導的系統信號能影響植物的抗病性水平，SA信號調控植物對活體營養病原菌以及半活體營養病原菌的抗性，而JA和ET的組合則激活植物對腐生營養病原菌的抗性[24]，通常這兩個信號途徑起相反的作用，提高對活體營養病原菌的抗性會伴隨著對腐生營養病原菌的感病性的增加，反之亦然[25]。我們發現TaTGA2.2的表達量在外源激素SA處理的早期顯著上調，而受JA和ET影響不大，表明TaTGA2.2可能與SA信號途徑介導的抗性相關。有研究發現TGA家族成員能與一個錨蛋白NPR1互作[21]，SA誘導下NPR1首先解聚形成單體，然后通過核孔進入到核中[26]，最后作為一個輔助激活因子結合TGA2形成PR1啟動子上的增強[27-28]。據此推斷，TaTGA2.2可能通過與NPR1互作參與SA信號途徑介導的小麥對條銹菌的防御反應。此外，一些bZIP蛋白還參與植物對環境因素脅迫的響應，包括鹽和干旱脅迫[19]。例如，ABF/AREB蛋白通過ABA依賴的信號轉導途徑響應干旱和鹽脅迫[29-30]。擬南芥中過表達ABF3和ABF4導致ABA/脅迫調控基因的表達水平改變，植株蒸騰作用減少及干旱耐受性增強[31]。試驗表明TaTGA2.2也受外源激素ABA以及干旱和高鹽脅迫誘導上調表達，推測TaTGA2.2可能還參與ABA信號介導的植物對干旱和高鹽脅迫的響應過程。

本研究利用VIGS技術對TaTGA2.2進行沉默，發現接種不同條銹菌小種以后表型沒有出現明顯差異。研究發現受SA類似物INA誘導的PR-1基因的表達以及病原體的抗性在擬南芥tga6-1tga2-1tga5-1三重突變體中被抑制，然而在tga6-12和tga2-1tga5-1突變體中則不被抑制。此外還發現單個TGA2或者TGA5就能補足由于TGA三重突變體導致的SAR表型的喪失，表明TGA2、TGA5和TGA6對誘導SAR是必要的，但功能上卻又是冗余的[32]。介于TaTGA2.2與擬南芥TGA2/5/6的高度同源性，推測小麥TGA家族成員也存在功能冗余，TaTGA2.2沉默后其他TGA家族成員能夠彌補由于TaTGA2.2沉默導致的功能缺陷。TaTGA2.2沉默后PR基因的表達水平與對照相比沒有明顯差異，進一步證實了以上推測。鑒于TGA家族成員能通過與NPR1互作在SA信號途徑中發揮重要作用，對沉默TaTGA2.2后NPR1的表達水平進行了檢測，發現其在120 h顯著上調，推測可能由于在非親和體系中，條銹菌的侵染誘導SA含量增加，NPR1的表達量隨之上調，而TaTGA2.2的沉默影響了NPR1與其之間互作層面的平衡關系，導致NPR1蛋白的積累，具體機理還有待進一步研究。