小立碗蘚擴展蛋白基因家族的鑒定與生物信息學分析

藍雨純 黃彬 韋嬌 姜山

摘 要： 擴展蛋白（Expansins， EXP）是一類基因家族，幾乎參與了植物發育的全過程，從種子萌發到果實成熟都有擴展蛋白的參與。該研究利用生物信息學的方法對小立碗蘚（Physcomitrella patens）Expansin基因家族成員進行鑒定，分析了其基因結構、染色體定位以及系統發生關系。結果表明：小立碗蘚基因組中含有Expansin A（EXPA）32個、Expansin-like A（EXLA）6個，并未發現Expansin-like B（EXLB）及Expansin B（EXPB）。擴展蛋白氨基酸序列長度在228～290 aa之間，編碼蛋白質具有兩個保守的結構域Pollen_allerg_1和DPBB_1。蛋白質亞細胞定位預測結果表明：運用CELLO在線工具預測發現小立碗蘚中約4/5的EXP家族基因定位于細胞外;而Euk-mPLoc預測結果則顯示小立碗蘚EXP基因家族成員全定位于細胞外。基因結構分析表明，小立碗蘚中約68% Expansin 基因有含有1～3個內含子。以上結果可為深入研究小立碗蘚擴展蛋白基因的分子進化與生物學功能奠定基礎。

關鍵詞： 小立碗蘚， 擴展蛋白， 基因家族， 生物信息學

中圖分類號： Q943 ?文獻標識碼： A

文章編號： 1000-3142（2020）06-0854-10

開放科學（資源服務）標識碼（OSID） ：

Abstract： Expansins （EXP） is a family of genes that are involved in the whole process of plant development. From seed germination to fruit ripening， there are Expansins involved. Bioinformatics methods were used to identify the members of the Expansin gene family of Physcomitrella patens， and their gene structures， chromosomal locations and phylogenetic relationships were analyzed. The results were as follows： Genome of the P. patens contains 32 Expansin A （EXPA） and 6 Expansin-like A （EXLA）， but Expansin-like B （EXLB） and Expansin B （EXPB） were not found. The Expansin amino acid sequence is between 228-290 aa in size， and the encoded protein has two conserved domains， Pollen_allerg_1 and DPBB_1. The results of protein subcellular localization prediction showed that about 4/5 of the EXP family genes in the P. patens were located outside the cell using the CELLO online tool; while the Euk-mPLoc prediction showed that the EXP gene family member was fully localized in extracellular. Gene structure analysis showed that about 68% of the Expansin gene in P. patens contains 1-3 introns. This study analyzed the basic information of the P. patens extended protein gene family， which lays a foundation for further study of the molecular evolution and biological functions of its extended protein genes.

Key words： Physcomitrella patens， Expansin， gene family， bioinformatics

植物細胞壁是植物細胞中是一種極其重要的結構。細胞壁能夠決定細胞的形狀，為細胞提供基本的機械支撐和硬度，是細胞抗擊病原體的最后一道屏障（Cosgrove， 2005）。擴展蛋白，即植物細胞壁松弛蛋白（Expansins， EXP），是一類細胞壁蛋白，主要存在于各植物細胞組織中，通過引起細胞壁組分間的松馳和細胞壁柔韌性增加，參與植物的許多生長發育過程。

在對黃瓜（Cucumic sativus）下胚軸細胞壁酸誘導伸展的研究實驗中，Cosgrove et al. （2002）首次發現EXP。實驗結果顯示：EXP可以使經熱鈍化后的細胞壁恢復伸展活性，但不具有溶菌酶活性，并且達到幾乎和離體細胞壁本身伸展活性相當的程度，以此推測其具有調節植物細胞壁的伸展性的功能（Javier et al.， 1992）。實驗證實EXP與許多生長發育過程相關，例如：Cosgrove et al. （2002）實驗發現果實成熟軟化和花粉管延伸有關;Belfield et al. （2005）研究表明EXP與葉片脫落有關;除此之外， Han et al. （2004）研究顯示EXP基因在植物抗逆中也有重要作用。早期研究表明，EXP以酶催化的作用方式，使細胞壁組分間疏松，細胞伸展，增強細胞柔韌性，以此緩解細胞在不良環境下的壓力（Cosgrove et al.， 1997）。近年來，隨著基因組測序技術的普及，越來越多的擴展蛋白在其他物種中被鑒定。依據進化關系，可將擴展蛋白基因家族劃分為四個亞家族：α、β、γ和δ。如今，科學研究在多種植物的不同生長階段都發現擴展蛋白存在。α- 和β-expansin家族分別被重命名為EXPA與EXPB，γ-expansin稱為Expansin-like A（EXLA）和δ-expansin稱為Expansin-like B（EXLB）（金慧清等，2006）。EXPA和EXPB亞家族蛋白具有細胞壁伸展活性，參與細胞壁伸長和其他發育過程（Hans et al.， 2004）;但EXLA和EXLB兩類亞家族僅僅知道其基因序列，暫無相關實驗證明EXLA和EXLB兩類亞家族蛋白具有增強細胞壁韌性的功能（Sampedro et al.， 2006）。

小立碗蘚（Physcomitrella patens）是非維管束植物類群的模式植物，進化地位特殊，全基因組也已測序完成，是研究功能基因組學、發育生物學、植物生理、系統進化理想材料。小立碗蘚基因組大小為511 Mb，共含27條染色體（Rensing et al.， 2002），有著易與外源基因發生同源重組、易培養且生長周期較短、表型易觀察等優勢。本研究基于2007年小立碗蘚的全基因組序列測序工作完成（http： //www.cosmoss.org/）（Rensing et al.， 2008），利用生物信息學的方法篩選鑒定小立碗蘚擴展蛋白基因家族成員，并對其進行進化樹構建，染色體定位、基因結構分析等。為后續研究該基因家族提供了參照。

1 材料與方法

1.1 材料

以模式植物小立碗蘚為研究對象，小立碗蘚全基因組數據下載于Ensembl Plants數據庫（Bolser et al.， 2017）（http：//plants.ensembl.org/index.html）中最新數據。

1.2 小立碗蘚Expansin基因家族的鑒定

由Ensembl數據庫（http：//asia.ensembl.org/index.html）中獲得小立碗蘚基因組相關數據;從Pfam數據庫（http：//pfam.xfam.org/）下載蛋白保守結構域的隱馬科夫模型文件（*.hmm）。利用HMMER軟件（Finn et al.， 2011）中hmmsearch工具搜索小立碗蘚全基因組預測蛋白序列中含有Pollen_allerg_1（PF01357）和DPBB_1（PF03330）保守結構域的序列（李昊陽等，2014），篩選E-value < 1 × 10-20的序列作為初篩序列。利用初篩序列及HMMER軟件重新構建小立碗蘚的特異性hmm文件，并利用該hmm文件再次進行篩選（E-value<0.01），篩選所得序列為備用序列。為保證搜索結果的準確性，通過SMART網站（http：//smart.embl-heidelberg.de/）對備用蛋白進行手動篩選（Letunic et al.， 2012），以手動剔除不含Pollen_allerg_1和DPBB_1兩個保守結構域的序列。

1.3 小立碗蘚擴展蛋白基因家族的蛋白特征分析及亞細胞定位

將鑒定得到的小立碗蘚擴展蛋白家族蛋白序列，通過NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫查找其分子量（Mw）、等電點（PI）等數據。通過Cello在線工具（http：//cello.life.nctu.edu.tw/）及Euk-mPLoc在線網站（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/）預測小立碗蘚EXP基因家族的亞細胞定位。

1.4 小立碗蘚Expansin家族系統進化樹的構建

利用小立碗蘚Expansin基因的蛋白序列，與TAIR據庫（https：//www.arabidopsis.org/）及NCBI數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索到的擬南芥（Arabidopsis thaliana）Expansin基因蛋白序列，應用多序列比對工具ClustalX構建系統進化樹，以氨基酸全序列聯配的結果為基礎，用MEGA 7.0程序生成。采用程序Maximum Likelihood法，校驗參數為Bootstrap=1 000。

1.5 小立碗蘚Expansin基因保守基序及基因結構分析

通過MEME網站檢測，小立碗蘚Expansin家族基因中所存在相似度較高的基序（motif）;并利用基因組注釋文件，獲得小立碗蘚Expansin基因家族的內含子及外顯子分布情況;最后利用TBtools軟件對其進行可視化分析。

1.6 小立碗蘚Expansin基因的染色體位置圖

以Phytozome數據庫（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）提供的相關基因信息， 確定Expansin基因的染色體定位。然后通過MapInspect軟件作圖（易吉明等，2015）。

2 結果與分析

2.1 小立碗蘚 Expansin 基因家族成員信息

通過 HMMER軟件對小立碗蘚全基因組預測蛋白序列進行搜索，共獲得91個備用蛋白。運用SMART 網站手動鑒定備用蛋白后，最終獲得38個小立碗蘚擴展蛋白（表1）。與雙子葉模式植物擬南芥中鑒定的擴展蛋白數量持平（Seader et al.， 2016）。

通過蛋白特征分析，小立碗蘚38個Expansin基因的分子量為25.14 kDa到73.95 kDa，其中約87%的擴展蛋白分子量處于20～30 kDa，等電點最小為4.14。這些小立碗蘚Expansin基因編碼的蛋白包含228 ～290個氨基酸。亞細胞定位預測結果顯示：運用CELLO在線工具預測發現小立碗蘚中約1/5的EXP家族基因定位于細胞周質;而Euk-mPLoc預測結果則顯示小立碗蘚EXP基因家族全定位于細胞外。Pfam數據庫（http：//pfam.xfam.org）驗證結果顯示38個擴展蛋白同時具有Pollen_allerg_1和DPBB_1特征結構域。

2.2 小立碗蘚 Expansin 基因保守結構域與基因結構分析

通過MEME分析小立碗蘚Expansin基因序列，獲得10個保守性較高的motif（圖1：A）。同時，motif之間的位置具有重要規律，其中發現小立碗蘚EXPA亞家族除PpEXPA32出現motif 1缺失外，該亞家族其余基因具有motif 2-（motif 8）-motif 4-motif 1-motif 3的相對穩定結構;而EXLA亞家族則具有motif 2-motif 9-motif 7-motif 10-motif 6的穩定結構，并未出現motif缺失、增加或替換。

分析38個小立碗蘚EXP基因的內含子、外顯子結構（圖1：B），發現EXPA中約49%的基因含有2個內含子、約1/5的基因僅含有1個內含子、9%的基因含有3個內含子、有約22%的EXPA亞家族基因不含內含子。在分析小立碗蘚EXLA亞家族時發現，EXLA幾乎僅含1個內含子，除PpEXLA1和PpEXLA4外。其中PpEXLA1含有5個內含子，為Expansin基因家族中含有內含子數目最多的基因。

2.3 小立碗蘚擴展蛋白基因家族的系統進化分析

對小立碗蘚Expansin基因家族進行了氨基酸多序列比對和系統樹構建（圖2），分析表明，小立碗蘚的Expansin基因家族系統進化樹有3個非常明顯的分枝，且小立碗蘚Expansin基因家族的兩個亞基因家族都出現了獨立的進化分支。其中EXPA亞家族包含兩個進化分支，說明EXPA亞家族的基因在長期的進化過程中，出現了不同的進化方式。另外，小立碗蘚中有些Expansin基因分支較長，說明這些基因在很早的時候就發生了分化，相應基因序列也已經發生較大的分化，但仍然可以肯定它們之間具有一定的演化關系。

為研究模式植物小立碗蘚與擬南芥基因組中EXP之間的進化關系，利用38個小立碗蘚EXP基因和38個擬南芥擴展蛋白的氨基酸序列構建了系統發育樹（圖3）。從系統發育樹可知，小立碗蘚38個EXP基因被明顯分為2個亞家族。共鑒定種內的直系同源蛋白12對，其中有4對直系同源蛋白間的Bootstrap值為99，而物種內的旁系同源蛋白數目為1。

2.4 小立碗蘚EXP基因家族的染色體位置

通過Phytozome數據庫獲得小立碗蘚EXP基因家族染色體定位信息，將小立碗蘚中38個擴展蛋白定位在15條染色體上，圖4顯示小立碗蘚第8條、第14條染色體上均定位了6個EXP基因。根據基因簇的定義可發現小立碗蘚EXP基因家族在第14條染色體上出現了小規模的基因簇（Bai et al.， 2002）。另7條染色體上均只含1個基因，3條染色體含有2個基因，可見小立碗蘚38個Expansin基因在染色體上分布是不均勻的。

3 討論

擴展蛋白是植物細胞壁的重要組分，主要參與細胞擴張以及一系列發生細胞壁修飾的發育過程以及植物抗病的重要生理過程。研究鑒定小立碗蘚中含有38個擴展蛋白，可進一步分類為EXPA亞家族及 EXLA亞家族。小立碗蘚EXP基因的兩個亞家族之間在基因內含子外顯子分布、motif結構等方面具有一定的保守性，代表了亞家族的重要特征， 研究發現EXPA亞家族中約70%的基因含有1～ 2個內含子，另有約22%的EXPA亞家族基因不含內含子;而EXLA亞家族幾乎僅含1個內含子。基序分析表明，EXPA亞家族及EXLA亞家族均含有 motif 2;EXLA亞家族基因均含有motif 2-motif 9-motif 7-motif 10-motif 6的穩定結構，比EXPA亞家族更具有保守性。同一亞家族內的EXP基因含有保守的內含子與外顯子結構和motif特征，而不同亞家族之間motif的多樣化也表明了小立碗蘚EXP基因在一定程度上參與細胞內的多種代謝途徑。通過染色體定位發現，在小立碗蘚Expansin基因隨機分布15條染色體上，除14號染色體外，基本不形成基因簇。

EXP基因在植物體的生長發育及逆境脅迫中具有重要的生理意義，已成為植物體基因功能研究熱點之一，但其在小立碗蘚中的基因功能尚不明確。本研究通過對已有數據庫數據的分析，使用生物學信息的方法手段，篩選得到38個小立碗蘚擴展蛋白基因家族成員，分析其蛋白特征、進化關系、基因結構及染色體定位等。從基因水平上展示小立碗蘚種屬的特征，為后續研究擴展蛋白基因功能提供了理論依據。

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（責任編輯 周翠鳴）