馬尾松細胞分裂素羥化酶基因PmCYP735A克隆與表達分析

徐夢璇 吳玲 類彥東 徐立安 胥猛

摘 要： 該文首次在針葉樹種馬尾松（Pinus massoniana）中采用cDNA末端快速克隆（RACE）技術克隆，并鑒定出1個CYP735A基因。結果表明：馬尾松CYP735A基因（PmCYP735A）cDNA全長為1 744 bp，包括1 647 bp的開放閱讀框，44 bp的5′端非翻譯區和53 bp的3′端非翻譯區。該基因編碼蛋白由548個氨基酸殘基組成，其二級結構含有豐富的α-螺旋和無規則卷曲。該基因編碼蛋白不含跨膜區域，且無信號肽酶切位點，在399～406個和475～484個氨基酸殘基存在P450超家族保守特征序列ETLRLYP（ExxRxxP）和血紅素結合區域（Heme-binding region）FSFGPRKCVG（FxxGxRxCxG）。系統進化樹分析表明，馬尾松PmCYP735A與水稻、玉米、擬南芥CYP735A蛋白歸屬于同一小的進化枝，可可、毛果楊、麻風樹和橡膠樹等的CYP735A同源蛋白相對集中的定位于另一進化分支。實時定量PCR檢測發現，PmCYP735A基因在馬尾松根和莖中的表達量顯著高于葉，該基因響應外源生長素NAA誘導表達，隨著誘導時間呈現先上升再下降的表達趨勢。以上結果有助于深入探究CYP735A基因家族的生物學功能及其在物種間的表達調控異同，為進一步挖掘馬尾松優異基因資源奠定基礎。

關鍵詞： 細胞分裂素羥化酶， RACE， 表達模式， 馬尾松， 系統進化分析

中圖分類號： Q943 ?文獻標識碼： A

文章編號： 1000-3142（2020）06-0864-09

開放科學（資源服務）標識碼（OSID） ：

Abstract： Cytokinin is a sort of adenine derivatives that can promote cell division and differentiation， which is widely involved in plant organ morphogenesis and stress response. Cytokinin hydroxylase CYP735A belongs to the cytochrome P450 monooxygenase superfamily. It regulates the content of isoprenyl adenine and trans-zeatin in plants through hydroxylation reaction and plays an important role in plant growth and development. Up to now， there were few researches about gene cloning and analysis of cytokinin hydroxylase in woody plants. In this study， one CYP735A homologous gene was firstly cloned and identified in Pinus massoniana through the rapid amplification of cDNA ends （RACE）. The results were as follows： The full-length of cDNA of PmCYP735A was 1 744 nucleotides， including 1 647 bp open reading frame （ORF）， 44 bp 5′-untranslated region （UTR） and 53 bp 3′-UTR. PmCYP735A encoded a protein of 548 amino acids， and its secondary structure was rich in alpha helix and random coil. PmCYP735A protein did not contain either transmembrane region or signal peptidase cleavage site. But two conserved motifs of P450 superfamily such as ETLRLYP （ExxRxxP） and heme-binding region FSFGPRKCVG （FxxGxRxCxG） were existed in amino acid sequence of 399-406 aa and 475-484 aa， respectively. The phylogenetic tree showed that PmCYP735A was clustered into the same evolutionary branch with homologous of Arabidopsis thaliana， Oryza sativa and Zea mays， while CYP735A homologous proteins from Theobroma cacao， Populus trichocarpa and Jatropha curcas were classified in another evolutionary branch. The results of qRT-PCR showed that PmCYP735A expressed significantly higher in roots and stems than in leaves. Furthermore， the gene responded to exogenous auxin NAA with a increased firstly and then decreased gene expression trend over treatment time in all three tissues. These results will be valuable for further study of the biological function of CYP735A homologous genes in woody plants and enrich the excellent genetic resources of Pinus massoniana.

Key words： cytokinin hydroxylase， RACE， expression pattern， Pinus massoniana， phylogenetic analysis

細胞分裂素（cytokinin）是一類促進細胞分裂與分化的腺嘌呤衍生物，根據其嘌呤環第6位氮原子（N6）上側鏈結構，天然細胞分裂素可分為異戊二烯類和苯環類，后者在植物體內含量極微。異戊二烯類是細胞分裂素在植物體內的主要存在形式，包括反式玉米素（trans-zeatin，tZ）、異戊烯基腺嘌呤（isopentenyl adenine，iP）、順式玉米素（cis-zeatin，cZ）、二氫玉米素（dihydrozeatin，DZ）以及它們的核苷、核苷酸和糖苷等（Takei et al.， 2004;Sakakibara，2006）;不同結構形態（iP/tZ/cZ及其核苷、核苷酸和糖苷等）的功效組分在不同植物和同種植物的不同組織器官或發育階段會有較大差異，同時它們在特定條件下還可以相互轉化以維持和調節游離態細胞分裂素的活性水平（張紅梅等，2003;Kieber & Schaller，2018）。細胞分裂素的生物合成有兩種方式，即tRNA分解和從頭合成。tRNA通過釋放出cZ并在順反異構酶的催化下轉化成高活性tZ，這條途徑是其生物合成的次要途徑（Mok & Mok，2001;Haberer & Kieber，2002;Veach et al.， 2003）;以異戊烯基側鏈為底物的從頭合成是大多內源細胞分裂素產生的主要途徑（鄧巖等，2006）。人們對細胞分裂素從頭合成途徑的了解和認知源于幾種關鍵酶及其編碼基因的發現（Takei et al.， 2004;Sakakibara，2006;鄧巖等，2006;李志康等，2018）。異戊烯基轉移酶（isopentenyl transferase，IPT）是細胞分裂素合成的限速酶，可催化磷酸腺苷（ATP/ADP/AMP）與二甲基丙烯基二磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP）作用轉化為磷酸異戊烯基腺苷（iPRTP/iPRDP/iPRMP），繼而產生異戊烯基腺苷（iP riboside，iPR）;細胞分裂素羥化酶CYP735A能將上述磷酸異戊烯基腺苷經羥基化轉化為反式玉米素核苷（tZRTP/tZRDP/tZRMP），并合成反式玉米素核苷（tZ riboside，tZR）。LONELY GUY（LOG）基因編碼的磷酸核糖水解酶可以進一步將iPR和tZR轉化為具有生物活性的、自由基形式的iP和tZ，與此同時，細胞分裂素的合成代謝還受到細胞分裂素氧化酶、N-葡糖基轉移酶、玉米素-O-葡糖基轉移酶和β-葡糖苷酶等的精確調控（鄧巖等，2006;李志康等，2018;Kieber & Schaller，2018）。

馬尾松（Pinus massoniana）是松科松屬針葉樹種，為多年生常綠喬木，在蘇、皖、浙、湘、贛、閩、云貴及兩廣地區均有分布。馬尾松長勢快、干形通直且耐干旱貧瘠，是我國南方地區重要的荒山造林和工業用材樹種。松木廣泛應用于建筑、枕木、礦柱、家具及制漿造紙等，從樹干可割取松脂，為醫藥和化工原料，從樹皮可提取栲膠，根部可用來培養茯苓等蕈類，系名貴滋補中藥材。細胞分裂素羥化酶CYP735A屬于細胞色素P450單加氧酶家族成員，它通過羥基化作用調控植物體內tZ的含量水平，在植物莖的生長發育過程中扮演關鍵角色（Kiba et al.， 2013;Cai et al.， 2018）。在林木樹種中，鮮有細胞分裂素羥化酶基因克隆和鑒定的相關報道。本研究首次在針葉樹種馬尾松中克隆和鑒定了細胞分裂素羥化酶（cytochrome P450 monooxygenase，family 735，subfamily A）基因CYP735A，以期進一步展開CYP735A基因家族的生物學功能研究及其在不同物種間的表達調控異同。

1 材料與方法

1.1 植物材料及RNA提取

植物材料為光照培養箱條件下的馬尾松實生苗。用5 μmol·L-1濃度的NAA溶液澆灌馬尾松幼苗（5周苗齡），分別于0（CK）、1 、2 、4、8 h五個時間點取其根、莖和葉組織樣本，經液氮速凍后于-80 ℃保存。使用RNApre Pure Plant Kit（Polysaccharides & Polyphenolics-rich）（TIANGEN，北京）提取上述植物材料總RNA，經NanoDropTM 2000紫外分光光度計測定總RNA濃度，并使用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。

1.2 基因克隆

根據已獲得的目的基因片段序列設計RACE特異引物（表1），以未處理的馬尾松幼苗RNA為模板，參照SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit操作指南進行目的基因3′-RACE和5′-RACE巢式PCR擴增，并經產物回收、連接、轉化、序列測定、拼接、開放閱讀框（open reading frame，ORF）預測及測序驗證，最終獲得目的基因cDNA全長序列。

1.3 序列分析

使用BioEdit軟件對候選基因片段、3′RACE和5′RACE序列進行比對拼接，基于獲取的候選基因cDNA全長序列，利用在線分析工具FGENESH預測ORF;利用在線軟件Expasy Protparma和ProtScale分析候選基因編碼蛋白的理化性質，包括蛋白質分子量、理論等電點、氨基酸組成以及疏水性;使用TMHMM v.2.0 Server、SignalP 4.1 Server和Cell-Ploc 2.0工具進行目的蛋白跨膜區、信號肽和亞細胞定位預測;通過Pfam數據庫預測候選基因編碼蛋白質的保守結構域，并借助SOPMA和Swiss-Model軟件預測蛋白質的高級結構。

1.4 系統進化樹構建

不同物種的氨基酸序列使用DNAMAN軟件進行多重比對，使用MegaX軟件并采用鄰接法構建系統進化樹。

1.5 實時定量PCR

將前述樣品的總RNA經PrimeScriptTM RT Master Mix（TaKaRa，大連）反轉錄合成cDNA。在ViiATM 7平臺，使用不飽和熒光染料FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）開展候選基因實時定量PCR檢測，反應體系和反映程序參照其說明書。每個樣品均進行三次技術重復，以UBI4基因（Chen et al.， 2016）為內參基因，基于2-ΔΔCt算法進行目的基因在NAA處理不同時間的不同組織中的相對表達分析。

2 結果與分析

2.1 馬尾松PmCYP735A基因克隆及序列分析

通過NCBI數據庫比對結果顯示，目的基因所編碼蛋白質具備P450結構域，且與其他物種細胞分裂素羥化酶同源性較高。將該基因編碼氨基酸序列與擬南芥（Arabidopsis thaliana）細胞色素P450家族所有成員進行BLAST比對和系統進化分析，發現該預測蛋白質與擬南芥CYP735A家族關系最為接近。由于之前尚未有CYP735A基因亞家族在針葉樹種中克隆和驗證的報道，因此將該基因命名為PmCYP735A。馬尾松PmCYP735A基因cDNA全長為1 744 bp，其中包括1 647 bp的ORF區域、44 bp的5′端非翻譯區（5′-UTR）和53 bp的3′端非翻譯區（3′-UTR）。該基因序列在45～47位為起始密碼子ATG，下游存在同框終止密碼子TAG和ployA尾（圖1）; 可編碼548個氨基酸， 其編碼蛋白質分子式為C2793H4406N770O773S26，相對分子質量（MW）為61.93 kD，理論等電點（pI）為9.37;不穩定系數為37.04，為穩定蛋白;總親水性平均系數為-0.118，預測其為親水性蛋白。

2.2 二級結構與三級結構預測

馬尾松CYP735A基因編碼蛋白不含跨膜區域，預測位于內質網，且無信號肽酶切位點，推測該編碼蛋白為非分泌性親水性蛋白。其二級結構含有52.55%的α-螺旋（Alpha helix）、10.95%的延伸鏈（Extended strand）、4.74%的β-轉角（Beta turn）和31.75%的無規則卷曲（Random coil）（圖2：A）。以CYP BM3（Cytochrome P450 pentamutant from BM3 with bound PEG）（SMIT ID：4zf6.1）為模板，獲得馬尾松PmCYP735A蛋白質三級結構（圖2：B），兩者的序列具有26.26%的一致性，模板覆蓋率為83%。

2.3 馬尾松CYP735A蛋白質保守結構域分析

Pfam數據庫檢索顯示，馬尾松PmCYP735A蛋白質在4～349個氨基酸殘基范圍內存在P450蛋白的保守結構域。目前，有關CYP735A亞家族蛋白的功能研究較為缺乏，NCBI數據庫Blast比對顯示，馬尾松PmCYP735A氨基酸序列與擬南CYP735A1（Arabidopsis thaliana，NP_001331437.1）（Takei et al.， 2004）和麻風樹（Jatropha curcas，XP_012077971.1）（Cai et al.， 2018）的一致性分別為51%和52%。將PmCYP735A蛋白與擬南芥AtCYP735A1和AtCYP73A2、麻風樹JcCYP735A、水稻OsCYP735A3（Oryza sativa，XM_015794046.2）和OsCYP735A4（XM_015755276.1）和玉米ZmCYP735A（Zea mays，PWZ_25384.1）（李曉麗，2011）等已有文獻報道的CYP735A同源蛋白進行多重序列比對（圖3）。所有已知的細胞色素P450家族成員都含有保守的血紅素結合域（heme-binding region），通過多序列比對發現在PmCYP735A蛋白在399～406個和475～484個氨基酸殘基存在保守特征序列ETLRLYP（ExxRxxP）（Hasemann et al.， 1994）和血紅素結合區域（heme-binding region）FSFGPRKCVG（FxxGxRxCxG）（Nelson et al.， 1993）。

2.4 CYP735A蛋白系統進化分析

將上述已有文獻報道的CYP735A家族蛋白與可可TcCYP735A（Theobroma cacao，EOY_04208.1）、向日葵HaCYP735A（Helianthus annuus，OTG_05700.1）、毛果楊PtCYP735A（Populus trichocarpa，XP_006383462）、蓖麻RcCYP735A（Ricinus communis，XM_002516677.2）、橡膠樹HbCYP735A（Hevea brasiliensis，XP_021643892.1）和川桑MnCYP735A（Morus notabilis，EXB_97152.1）等其他物種基因組上預測到的部分CYP735A同源蛋白經多重序列比對后構建系統進化樹（圖4）。馬尾松PmCYP735A與水稻、玉米、擬南芥CYP735A蛋白歸屬于同一小的進化枝，而可可、毛果楊、麻風樹和橡膠樹等的CYP735A同源蛋白相對集中的定位于另一進化分支。

2.5 PmCYP735A基因表達模式分析

為了檢測PmCYP735A基因在馬尾松不同組織及外源激素NAA處理下的表達模式，以UBI4為內參基因，進行目的基因實時定量PCR檢測。圖5結果顯示，PmCYP735A基因在馬尾松根、莖中的表達量顯著高于葉。在使用5 μmol·L-1濃度NAA溶液澆灌處理條件下，0～2 h內PmCYP735A基因在各組織中的表達量呈上升趨勢，2～4 h內該基因在各組織中的表達量急劇下降。尤其是該基因快速地響應外源生長素NAA誘導表達，且先上升再下降的這一表達趨勢在根、莖、葉中保持一致（圖5）。

3 討論

植物激素是植物正常代謝所產生的一類對其生長發育和脅迫響應有顯著作用的微量有機化合物，包括生長素（auxin）、細胞分裂素、赤霉素（GA）、乙烯（ETH）、脫落酸（ABA）、油菜素內酯（brassinosteroid，BR）等。細胞分裂素與其它信號途徑之間存在較為活躍的相互作用，它通過對細胞增殖與分化的調節廣泛參與調控植物形態建成、頂端優勢、營養物質運輸及逆境適應等（鄧巖等，2006;李志康等，2018）。反式玉米素（tZ）和異戊烯基腺嘌呤（iP）是植物體內細胞分裂素主要的活性形式，前者主要在根系中合成并通過木質部轉運至葉片，后者主要在地上部分合成并通過韌皮部運輸至根系發揮作用（Ko et al.， 2014;Zhang et al.， 2014;李志康等，2018）。細胞分裂素羥化酶CYP735A催化核苷酸形式的iPR轉化成核苷酸形式的tZR，從而參與調節不同細胞分裂素組分在植物體內的動態平衡。

在擬南芥中存在AtCYP735A1和AtCYP735A2兩個細胞分裂素羥化酶基因，其氨基酸序列一致性為79%， 它們主要在根莖維管束中表達。AtCYP735A1在根、莖、葉和花中均有低量表達，AtCYP735A2主要在根維管束表達;其雙突變體擬南芥植株，根莖tZ含量降低，莖的生長發育受抑制（Takei et al.， 2004;Kiba et al.， 2013）。基于最近麻風樹JcCYP735A基因的研究報道，有理由相信CYP735A同源基因在多年生木本植物中有相似的生物學功能，在根中參與合成tZ，tZ通過木質部轉運至地上部分調控相應組織器官的生長發育。JcCYP735A基因在麻風樹所有的組織器官中均有表達，根中表達量最高;其敲除轉基因植株生長發育嚴重滯后，株高僅僅是對照植株的四分之一，葉片tZ、tZR、cZ和cZR的含量顯著降低（Cai et al.， 2018）。

迄今為止，還沒有克隆和鑒定針葉樹種CYP735A基因的有關報道。本研究通過RACE和測序驗證獲取了馬尾松PmCYP735A基因cDNA全長序列，并對其進行了生物信息學分析和表達模式實時定量PCR檢測，旨在探究其生物學功能及它們在物種間的表達調控異同，并為進一步挖掘馬尾松優異基因資源奠定基礎。

參考文獻：

CAI L， ZHANG L， FU Q， et al.， 2018. Identification and expression analysis of cytokinin metabolic genes IPTs， CYP735A and CKXs in the biofuel plant Jatropha curcas [J]. Peer J， 6（2）： e4812.

CHEN H， YANG Z， HU Y， et al.， 2016. Reference genes selection for quantitative gene expression studies in Pinus massoniana L. [J]. Trees， 30（3）： 685-696.

DENG Y， WANG XC， YANG SH， et al.， 2006. New insights into cytokinins： Metabolism， signal transduction， cross talks and potentials in agricultural applications [J]. Chin Bull Bot， 23（5）： 478-498. [鄧巖， 王興春， 楊淑華， 等， 2006. 細胞分裂素：代謝、信號轉導、交叉反應與農藝性狀改良 [J]. 植物學通報， 23（5）：478-498.]

HABERER G， KIEBERJJ， 2002. Cytokinins： New insights into a classic phytohormone [J]. Plant Physiol， 128（2）： 354-362.

HASEMANN CA， RAVICHANDRAN KG， PETERSONJA， et al.， 1994. Crystal structure and refinement of cytochrome P450terp at 2.3 A resolution [J]. J Mol Biol， 236（4）： 1169-1185.

KIBA T， TAKEI K， KOJIMA M， et al.， 2013. Side-chain modification of cytokinins controls shoot growth in Arabidopsis [J]. Dev Cell， 27（4）： 452-461.

KIEBER JJ， SCHALLER GE， 2018. Cytokinin signaling in plant development [J]. Development， 145（4）： dev149344.

KO D， KANG J， KIBA T， et al.， 2014. Arabidopsis ABCG14 is essential for the root-to-shoot translocation of cytokinin [J]. Proc Natl Acad Sci USA， 111（19）： 7150-7155.

LACOMBE B， ACHARD P， 2016. Long-distance transport of phytohormones through the plant vascular system [J]. Curr Opin Plant Biol， 34： 1-8.

LI XL， 2011. Establishment of immature embryo transgenic acceptor system and transformation of CYP735A gene by agrobacterium tumefaciens in three maize inbred-lines [D]. Taian： Shandong Agricultural University. [李曉麗， 2011. 3個玉米自交系幼胚轉化受體系統建立和CYP735A基因的農桿菌介導轉化 [D]. 泰安：山東農業大學.]

LI ZK， YAN D， XUE ZY， et al.， 2018. Regulations of plant growth and development by cytokinins and their applications in rice production [J]. Chin J Rice Sci， 32（4）： 311-324. [李志康， 嚴冬， 薛張逸， 等， 2018. 細胞分裂素對植物生長發育的調控機理研究進展及其在水稻生產中的應用探討 [J]. 中國水稻科學， 32（4）：311-324.]

MOK DW， MOK MCM， 2001. Cytokinin metabolism and action [J]. Ann Rev Plant Physiol， 52（52）： 89-118.

NELSON DR， KAMATAKI T， WAXMAN DJ， et al.， 1993. The P450 superfamily： Update on new sequences， gene mapping， accession numbers， early trivial names of enzymes， and nomenclature [J]. DNA Cell Biol， 12（1）： 1-51.

NELSON DR， MING R， ALAM M， et al.， 2008. Comparison of cytochrome P450 genes from six plant genomes [J]. Trop Plant Biol， 1（3-4）： 216-235.

SAKAKIBARA H， TAKEI K， HIROSEN， 2006. Interactions between nitrogen and cytokinin in the regulation of metabolism and development [J]. Trends Plant Sci， 11（9）： 440-448.

TAKEI K， YAMAYA T， SAKAKIBARA H， 2004. Arabidopsis CYP735A1 and CYP735A2 encode cytokinin hydroxylases that catalyze the biosynthesis of trans-zeatin [J]. J Biol Chem， 279（40）： 41866-41872.

VEACH YK， MARTIN RC， MOKD WS， et al.， 2003. O-glucosylation of cis-zeatin in maize characterization of genes， enzymes， and endogenous cytokinins [J]. Plant Physiol， 131（3）： 1374-1380.

ZHANG HM， WANG JL， LIAO XR， 2003. Biosynthesis， metabolism and receptor of cytokinins [J]. J Plant Physiol， 39（3）： 267-272. [張紅梅， 王俊麗， 廖祥儒， 2003. 細胞分裂素的生物合成、代謝和受體 [J]. 植物生理學報， 39（3）：267-272.]

ZHANG K， NOVAK O， WEI Z， et al.， 2014. Arabidopsis ABCG14 protein controls the acropetal translocation of root-synthesized cytokinins [J]. Nat Comm， 5（2）： 3274.

（責任編輯 蔣巧媛）