乳腺癌CDK4／6抑制劑設(shè)計策略的生物信息學(xué)研究

郭向陽 李 嘉 梁 帥 李炘正

（山西省腫瘤醫(yī)院乳腺外科二病區(qū) 山西太原 030013）

由于早期不易被發(fā)現(xiàn)、高危因素較復(fù)雜、病因尚不明確等原因，乳腺癌一直是女性中最常見的惡性腫瘤類型［1］。在全球范圍內(nèi)，乳腺癌每年的新增病例可達130 萬人，占惡性腫瘤總發(fā)病率的23%以上，且至今仍位居女性癌癥死亡率之首［2］。為應(yīng)對如此嚴峻的乳腺癌現(xiàn)況，研究人員嘗試了多種治療方法，其中最為引人注目的當屬近年來新興的針對細胞周期調(diào)控的細胞周期蛋白依賴性激酶4／6（CDK4／6）抑制劑的應(yīng)用［3］。

細胞分裂行為的失控是癌癥的主要特征性表現(xiàn)，因此對細胞周期的干預(yù)為癌癥的治療提供了新的思路。1996年，Cervantes M 等［4］最先提出了CDK4／6 在乳腺癌細胞周期出現(xiàn)改變時發(fā)揮的作用。CDK 即細胞周期蛋白依賴性激酶，該蛋白家族目前已發(fā)現(xiàn)多種亞型，它們可分別與一種細胞周期蛋白（cyclin）結(jié)合，對下游信號蛋白進行磷酸化，使其分泌信號分子，進而調(diào)節(jié)整個細胞周期，控制細胞分裂行為。其中，CDK4／6 均可與cyclin D 結(jié)合，介導(dǎo)下游視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白（Rb）的磷酸化，釋放與Rb 結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子E2F，最終使細胞完成從G1 期向S 期的過渡［5］。因此，研發(fā)針對CDK4／6的抑制劑將有效抑制腫瘤細胞的增殖與發(fā)展。截至2019年，已有3 種CDK4／6抑制劑藥物獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）的審批：palbociclib（PD0332991）、ribociclib（LEE011）和abemaciclib（LY2835219）［6］，均作為雌激素受體陽性（HR+）且人類表皮生長因子受體2 陰性（HER2-）的乳腺癌晚期患者的特效藥在美國上市［7-8］。臨床研究表明，在使用以上3 種藥物進行治療后，患者的無進展生存期（PFS）均得到了顯著延長。然而，隨著這3 種藥物投入市場并改善了眾多乳腺癌患者的健康狀況，它們所帶來的問題，即耐藥性問題也日益被人們關(guān)注。越來越多的證據(jù)表明，乳腺癌細胞已經(jīng)對CDK4／6抑制劑產(chǎn)生了各種途徑的耐藥性變異，例如通過影響FGFR-1 受體及TGF-β 通路使CDK4／6抑制劑失效等［9-10］，這些問題也逐漸限制了當前已有的CDK4／6抑制劑的使用。因此，如何改進現(xiàn)有的CDK4／6抑制劑，在解決耐藥性問題的同時探索更為多元化的癌細胞抑制方案，已成為當前乳腺癌治療領(lǐng)域的一大難題。

本文將針對CDK4／6抑制劑的改進問題，利用多種生物信息學(xué)工具對該類藥物的設(shè)計策略作出預(yù)測分析，通過研究CDK4／6 的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、翻譯后修飾位點、參與的生物學(xué)過程及通路等問題，以期為新型CDK4／6抑制劑的研發(fā)鋪墊理論基礎(chǔ)，為探索多元化癌細胞抑制方案提供新的思路和角度。

1 材料與方法

1.1 材料 CDK4（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/CAG47043.1）及CDK6（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_001250.1）的蛋白序列均在美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）的蛋白庫中獲得。1.2 方法 通過三維建模軟件SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）對CDK4／6 蛋白進行三維結(jié)構(gòu)建模分析，掌握CDK4／6 最為可能的三維構(gòu)象。

通過以下3 種軟件分別對CDK4／6 的蛋白磷酸化位點進行預(yù)測：DISPHOS 1.3（http://www.dabi.temple.edu/disphos/），SCANSITE 4.0（http://scansite3.mit.edu/），NetPhos 3.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）；綜合3 種軟件的預(yù)測結(jié)果，得到可信度較高的蛋白磷酸化位點。通過NetNGlyc 1.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）對2 種蛋白的N-糖基化位點進行預(yù)測。通過NetOGlyc4.0 Server（http://cbs.dtu.dk/services/Net－OGlyc/）及YinOYang 1.2 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/YinOYang/）對2 種蛋白的O-糖基化位點進行預(yù)測。如無特殊說明，各預(yù)測軟件均采用默認參數(shù)進行預(yù)測，且物種均選擇為人類。

通過STRING（https://string-db.org/）軟件分別構(gòu)建2 種蛋白的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，并對其進行GO 及KEGG 分析，得到2 種蛋白在人體各種分子活動及生物過程中參與情況的分析。

部分蛋白質(zhì)相關(guān)信息由NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫及Uniprot（http://www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫得到。

2 結(jié)果

2.1 CDK4／6 三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果 SWISSMODEL 分別對CDK4 及CDK6 進行了三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測分析。其中，該軟件對CDK4 的氨基酸序列通過50 個模板構(gòu)建出了2 個三維模型，相比而言，圖1 所示的模型更有可能是CDK4 的真實三維模型。該模型的序列識別率達到了100%，且模型覆蓋全部序列，其GMQE 值為0.96，QMEAN 值為-3.86，表現(xiàn)良好。由此可知，該模型的可信度較高，可為針對該蛋白研發(fā)抑制劑提供空間構(gòu)象的參考。此外，筆者觀察到該模型所顯示的CDK4 的三級結(jié)構(gòu)可能是由一段β-折疊連接的2 個球狀結(jié)構(gòu)域組成，這段β-折疊位于該蛋白氨基酸序列的第85 至第96 位，長度為12 個氨基酸殘基，且其中有一半的氨基酸為中性非極性疏水氨基酸，而酸性及堿性氨基酸均為2 個，因此這一鏈狀結(jié)構(gòu)應(yīng)為中性，且親水性較差。在該模型碳端的球狀結(jié)構(gòu)域中，有4 段α-螺旋（氨基酸序列第114 位至第134 位、第193位至第206 位、第266 位至第276 位、第286 位至第291 位）形成了特殊的平行結(jié)構(gòu)，稱為四螺旋束（four-helix bundle）結(jié)構(gòu)或“捆狀”結(jié)構(gòu)。

圖1 CDK4 的三級結(jié)構(gòu)

SWISS-MODEL 在預(yù)測CDK6 的三級結(jié)構(gòu)時，同樣以50 個模板進行建模，得出2 個可能的CDK6 三維模型。其中，擬合度最佳的結(jié)構(gòu)如圖2所示。該模型的序列識別率為100%，模型覆蓋全部序列，GMQE 值為0.97，QMEAN 值為-1.48，表現(xiàn)良好。因此有理由認為該模型可作為CDK6 三級結(jié)構(gòu)的參考模型。在該模型中，從CDK6 氨基酸序列第13 位至第99 位形成了由5 個反向平行的β-折疊片及1 個α-螺旋形成的帶有一定旋轉(zhuǎn)角度的折疊片結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)位于CDK6 的氮端。此外，該模型顯示，CDK6 序列的第119 位至第139 位、第199位至第214 位、第270 位至第281 位、第291 位至第301 位形成了由4 個α-螺旋組成的特殊結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域的4 條α-螺旋互相平行，結(jié)構(gòu)緊湊，也是一個較為典型的四螺旋束結(jié)構(gòu)。

圖2 CDK6 的三級結(jié)構(gòu)

2.2 蛋白修飾位點的預(yù)測結(jié)果

2.2.1 CDK4 的預(yù)測結(jié)果 3 種蛋白磷酸化位點預(yù)測軟件的預(yù)測結(jié)果如表1 所示，同時被2 種軟件命中的位點有4 個，分別為Y-17、T-172、S-243 和S-285。此外，只被1 種軟件命中，但得分較高的位點有T-53、S-81 和T-116。

表1 CDK4 的磷酸化位點預(yù)測結(jié)果

NetNGlyc 1.0 Server 的預(yù)測結(jié)果顯示，CDK4可能不存在N-糖基化位點。

NetOGlyc 4.0 Server 的預(yù)測結(jié)果顯示，CDK4可能的O-糖基化位點為S-243（得分0.625289）和S-259（得分0.782832）。YinOYang 1.2 Server 的預(yù)測結(jié)果顯示，CDK4 可能的O-糖基化位點為S－28（得分 0.5693）和 S -243（ 得分 0.5964）。雖然YinOYang 1.2 Server 也預(yù)測到了S-259 可能成為潛在的O-糖基化位點，但其得分僅為0.4447，沒有超過該位點的糖基化閾值，因此不能入選。由于S-243 同時被2 種軟件命中，所以成為O-糖基化位點的可能性較大。

2.2.2 CDK6 的預(yù)測結(jié)果 3 種蛋白磷酸化位點預(yù)測軟件的預(yù)測結(jié)果顯示（表2），同時被3 種軟件命中的位點分別為Y-24 和S-290，同時被2 種軟件命中的位點分別為S-138、T-177 和S-178。只被1 種軟件命中但得分較高的位點為S-223。

表2 CDK6 的磷酸化位點預(yù)測結(jié)果

NetNGlyc 1.0 Server 的預(yù)測結(jié)果顯示，CDK6可能不存在N-糖基化位點。

NetOGlyc 4.0 Server 共預(yù)測到5 個可能的O-糖基化位點，分別為：S-256（得分0.726857）、S-258（得分0.761364）、S-293（得分0.527362）、S-312（得分0.725641）和S-317（得分0.872224）。YinOYang 1.2 Server 的預(yù)測結(jié)果表明CDK6 可能的O-糖基化位點分別為：T-154（得分0.5230）、T-177（ 得分0.5753）、S-317（ 得分0.4940）和T-320（得分0.4782）。綜合2 種軟件，S-317 更有可能成為CDK6 的O-糖基化位點。

2.3 蛋白相互作用的預(yù)測結(jié)果 在線軟件STRING 分別對CDK4 及CDK6 的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)做出了預(yù)測分析，包括理化作用及生物學(xué)作用。在網(wǎng)頁中設(shè)置置信度為最高（0.900），產(chǎn)生互作的蛋白個數(shù)為10 個進行分析，結(jié)果顯示（圖3、圖4），與CDK4 產(chǎn)生相互作用的蛋白質(zhì)有：RB1、CCND1、CCND2、CCND3、CCNA2、CCNE1、CDKN2A、CDKN1B、CDKN1A 和CDKN2C；與CDK6 產(chǎn)生相互作用的蛋白質(zhì)有：CDKN2D、CCND2、CCND3、CCNA2、CCNE1、CDKN2A、CDKN1B、CDKN1A 和CDKN2C。也就是說，除了RB1 及CDKN2D 外，與CDK4／6 產(chǎn)生相互作用的蛋白均相同，且都為CCN蛋白家族與CDK 蛋白家族的成員，與CDK4／6 的互作關(guān)系也十分密切。

圖3 CDK4 的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖4 CDK6 的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

KEGG 通路分析結(jié)果顯示（表3），與CDK4/6形成蛋白網(wǎng)絡(luò)的蛋白涉及多條信號通路，其中CDK4/6 共同參與的信號通路有2 條，分別為p53信號通路及PI3K-Akt 信號通路。

表3 CDK4／6 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)涉及到的信號通路

GO 生物過程分析顯示，CDK4／6 主要參與了細胞周期調(diào)節(jié)、細胞生長及分化、有絲分裂、蛋白磷酸化、細胞及組織發(fā)育等多種與細胞分裂及分化相關(guān)的生物學(xué)過程。此外，還觀察到，CDK4／6還參與細胞對外界生物及非生物刺激的反應(yīng)、細胞對外部壓力的反應(yīng)等生物學(xué)過程。值得注意的是，CDK4 還參與了細胞對許多類型化合物的反應(yīng)，例如對有機環(huán)狀化合物的反應(yīng)、對氧氣水平的反應(yīng)、對有機含氮化合物的反應(yīng)、對藥物的反應(yīng)、對無機物質(zhì)的反應(yīng)、對酮的反應(yīng)、對酸性化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)等，因此可判斷CDK4 應(yīng)為一種在細胞中較為敏感的功能性蛋白。

3 討論

本研究通過多種生物信息學(xué)手段對CDK4／6的蛋白結(jié)構(gòu)、翻譯后修飾位點、蛋白相互作用關(guān)系等信息作出了預(yù)測，為CDK4／6 的多種生物學(xué)信息作出了系統(tǒng)且詳實的歸納與分析，對這2 種蛋白的認識更加全面且深入。以研究中得出的CDK4／6 相關(guān)信息為基礎(chǔ)，提出了以下幾點關(guān)于CDK4／6抑制劑的設(shè)計策略：

1）對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的掌握，有利于在設(shè)計蛋白質(zhì)的抑制劑時兼顧蛋白質(zhì)與其抑制劑的生物學(xué)作用效果及空間嵌合效果，為抑制劑有能力與目標蛋白發(fā)生可控反應(yīng)提供了條件和基礎(chǔ)。通過了解不同蛋白質(zhì)的特殊空間構(gòu)象，更易設(shè)計出針對某類蛋白的特效抑制劑，提高藥物的靶向能力，以最優(yōu)的解決方案降低副作用的發(fā)生風(fēng)險。本研究觀察到CDK4／6 均存在一些特殊的空間結(jié)構(gòu)。CDK4擁有一個中性且親水性較差的鏈狀結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域為一個兩端連有2 個不同大小球狀結(jié)構(gòu)的β－折疊鏈。從三維模型可看出，該結(jié)構(gòu)域較為暴露，因此可利用其中性及疏水的特性，設(shè)計出可結(jié)合在該結(jié)構(gòu)域上的“卡子”狀化合物破壞其空間構(gòu)象或?qū)⑵渌猓瑥亩_到抑制效果。CDK6 氮端的折疊結(jié)構(gòu)主要由5 個反向平行的β－折疊片構(gòu)成，這類結(jié)構(gòu)的特點是疏水殘基位于折疊片的一側(cè)，親水殘基位于另一側(cè)，因此在這一區(qū)域內(nèi)將出現(xiàn)電荷分布的極化，形成一端親電一端親核的極性結(jié)構(gòu)，有利于設(shè)計出易與該位點結(jié)合的藥物分子。此外，CDK4／6均擁有一個四螺旋束結(jié)構(gòu)，如果對這2 個四螺旋束進行進一步的結(jié)構(gòu)分析，探索螺旋束內(nèi)部的極性或官能團暴露情況，可能會為CDK4／6抑制劑的設(shè)計提供更可觀的方案。

2）細胞內(nèi)經(jīng)轉(zhuǎn)錄、翻譯形成的蛋白質(zhì)前體往往不具有生物學(xué)活性，需要經(jīng)過翻譯后的位點修飾才能擁有具體的特殊功能。本研究通過多種翻譯后修飾位點預(yù)測軟件對CDK4／6 的蛋白磷酸化位點、N－糖基化位點、O－糖基化位點作出了系統(tǒng)性預(yù)測。為使預(yù)測結(jié)果的可信度更高，綜合考慮了多種軟件對同一位點的預(yù)測評估，得到了最有潛力的翻譯后修飾位點。從分析結(jié)果可看出，CDK4／6均具有2～4 個可信度較高的蛋白磷酸化位點，均具有1 個可信度較高的O－糖基化位點，且都不存在N－糖基化位點。以這些修飾位點為基礎(chǔ)，綜合考慮這些位點在蛋白三級結(jié)構(gòu)中所處的位置，設(shè)計針對這些位點的抑制劑，對CDK4／6 進行再修飾，在確保不對正常通路造成破壞的前提下使其失去自身的生物學(xué)活性，或在CDK4／6 進行正常的蛋白修飾前占據(jù)其修飾位點，從源頭上抑制CDK4／6 的生成。這些思路均有望成為行之有效的CDK4／6抑制劑設(shè)計方案。

3）為應(yīng)對乳腺癌細胞對CDK4／6抑制劑產(chǎn)生的耐藥性問題，采用多元化的抑制手段或可奏效。蛋白互作分析結(jié)果顯示，CDK4／6 共同參與了p53信號通路及PI3K－Akt 信號通路。其中，p53 是CDKs 的抑制劑，可通過刺激p21（WAF1／CIP1）的表達抑制細胞周期的進程［11］。絲氨酸/蘇氨酸激酶（Akt）在細胞增殖、分化、代謝等生物學(xué)過程中起到非常重要的作用，是一種原癌基因的產(chǎn)物［12］。因此，可跳出單純針對CDK4／6抑制劑進行設(shè)計的思路，轉(zhuǎn)而從其共同參與的信號通路著手，一方面促進p53 的表達，另一方面抑制PI3K－Akt 信號通路的生物學(xué)過程，同樣可實現(xiàn)對CDK4／6 的抑制效果。同時注意到，與CDK4／6 產(chǎn)生相互作用的蛋白中，除了CDK 蛋白家族的相關(guān)成員外，大部分是CCN 蛋白家族的成員。CCN 蛋白是一類基質(zhì)細胞蛋白，研究表明，CCN 蛋白可影響腫瘤發(fā)展和腫瘤微環(huán)境中的多個病理生理過程，包括細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等［13－14］。因此，進一步研究CCN蛋白與CDK4／6 的作用形式，從信號通路、理化作用、生物作用等方面揭示CCN 蛋白與CDK4／6 的關(guān)系，尤其是加強二者之間的基礎(chǔ)研究，將對腫瘤的抑制和治療產(chǎn)生深遠的影響。此外，由于CDK4還參與細胞對多種化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)，設(shè)計出帶有多碳環(huán)、含氮官能團、羰基、羧基等基團的藥物，將可能對CDK4 產(chǎn)生較為敏感的抑制作用。綜合考慮CDK4／6 參與細胞對外界刺激及壓力的反應(yīng)，在乳腺癌的治療中加入合適的物理刺激，將為多元化的治療提供更為新穎的思路。

綜上所述，CDK4／6抑制劑的改進空間還很廣闊，未來將有望從空間特異性結(jié)合、修飾位點搶占及變構(gòu)、多通路多形式共同抑制等方面對CDK4／6抑制劑進行設(shè)計和改造。盡管本研究是通過生物信息學(xué)方法對CDK4／6抑制劑的設(shè)計提出理論上的策略，但多種工具的聯(lián)合使用確保了所得出結(jié)論的可靠性，因此所作的策略分析將為進一步的實驗論證提供多方面的理論基礎(chǔ)、思路和角度。相信隨著基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，人們在CDK 蛋白家族的抑制劑設(shè)計領(lǐng)域還將大有可為。