產胞外多糖植物乳桿菌XN1904E發酵乳特性研究

陳綺，雷文平，肖茜，姚慧，羅潔，劉成國，周輝

(1. 湖南農業大學 食品科學技術學院，長沙410128；2. 湖南省食品科學與生物技術重點實驗室，長沙410128；3. 湖南南山牧業有限公司，湖南城步422512）

0 引 言

乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB) 是一類能在生長代謝的過程中利用碳水化合物發酵產生乳酸的細菌，在自然界分布廣泛，種類繁多，截至目前為止共有23 個屬，200 多個種，菌株不計其數[1]。乳酸菌胞外多糖是乳酸菌在生長代謝過程中分泌到細胞壁外的一種糖類高聚物的總稱[2-3]。乳酸菌胞外多糖可以作為一種天然的食品添加劑，改善食品黏稠度、質地和風味等[4]，因此被廣泛應用于食品、醫藥等領域[5-7]。乳酸菌EPS 能夠賦予牛乳獨特的質地與口感，同時能夠增加發酵乳制品的粘稠度減少乳清析出[8]。

產胞外多糖乳酸菌與發酵劑協同發酵乳制品，旨在改善乳制品質地和口感，并利用乳酸菌產生的胞外多糖，改善乳制品黏度，增加乳制品的安全性。將產胞外多糖菌珠Y5 與不產胞外多糖的LB、ST 菌株按照2%接種量接種到牛乳中，結果表明菌株Y5 的乳清析出量減少，證明產胞外多糖的乳酸菌能夠提高產品的粘稠性[9]。

本研究以產胞外多糖植物乳桿菌XN1904E 為研究對象，將其與直投式發酵劑協同發酵組、發酵劑單獨發酵組和植物乳桿菌XN1904E 單獨發酵組進行發酵特性研究，測定發酵乳的多糖含量，并利用氣相色譜-質譜連用技術對各組發酵乳制品進行風味分析，該研究為開發利用產胞外多糖乳酸菌資源提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種，植物乳桿菌XN1904E 由本實驗室分離保存。MRS 肉湯培養基，廣東環凱微生物科技有限公司；瓊脂，Biosharp，葡萄糖，國藥集團化學試劑有限公司；蔗糖，國藥集團化學試劑有限公司；MRS 固體培養基：MRS 肉湯培養基中添加瓊脂15.0 g；MRS-S 液體培養基: MRS 肉湯培養基中的葡萄糖20 g 改為5 g，再加蔗糖50 g；直投式發酵劑，北京川秀國際貿易有限公司；脫脂乳粉，澳優乳業（中國）有限公司；濃硫酸，國藥集團化學試劑有限公司；苯酚，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

電子天平（PUCHUN 型），上海精密科學儀器有限公司；生化培養箱（GZ-400-S 型），韶關市廣智科技設備有限公司；雙人單面垂直凈化工作臺（SW-CJ-2D 型），蘇州博萊爾凈化設備有限公司；超級恒溫水浴鍋（601 型），金壇市醫療器廠；冷藏柜（SC-320C 型），青島海爾股份有限公司；氣質聯用儀（GCMS-QP2010 型），島津企業管理（中國）有限公司；數顯黏度計（NDJ-8S），上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種的活化

取-80 ℃保藏的菌種冷藏至室溫后，按5%的接種量接種于裝有250 mL MRS 液體培養基的500 mL 錐形瓶中中，37 ℃培養24 h，活化兩代后備用。

1.3.2 產胞外多糖植物乳桿菌（XN1904E）發酵特性研究

（1）菌種的馴化。

菌種擴大培養：將植物乳桿菌XN1904E 分別接種于MRS 液體培養基中，37 ℃擴大培養24 h，得到菌種的擴大培養液。

菌種馴化：將上述活化后菌液按照50%接種量（v/v）接種于10 mL 無菌的脫脂乳中37 ℃培養24 h，得到接種乳，再按照20%接種量（v/v）將接種乳接入到10 mL無菌脫脂乳中培養；之后每次馴化按照5%逐漸減少接種乳的添加量，增加無菌脫脂乳的量，控制總馴化次數為3～5 次；得到馴化好的菌種，其中菌種的含量控制在107～109CFU/mL[10]。

（2）發酵乳的制備。

參照方法[11]基礎上有所調整，12%脫脂復原乳→預熱(65～70 ℃)(混合均勻→殺菌(90～95 ℃，10 min) →冷卻(41～43 ℃) →接種各試樣組發酵劑（復配組；發酵劑組；XN1904E 組）接種量為3%→發酵(41 ℃，pH4.5 為發酵終點) →冷卻后熟(4～6 ℃放置12 h) →成品待測。

1.3.3 發酵乳pH 值和滴定酸的測定

（1）采用數顯pH 計測定發酵乳的pH 值。

（2）滴定酸度的測定：GB 5413.34-2010，食品安全國家標準乳和乳制品酸度的測定[14]。

1.3.4 發酵乳黏度的測定

將發酵乳置于室溫（25 ℃）一段時間后，采用數顯黏度測定儀測定發酵乳的黏度，參數設定為25 ℃，3#轉子進行測定，其中轉子轉速15 r/min、扭矩10%～100%、測定時間30 s，每個樣品平行做3次。

1.3.5 發酵乳多糖含量的測定

(1) 樣品處理。準確吸取1.3.2 -（2）中制備的發酵乳10 g，加入60 mL 無水乙醇，使乙醇體積分數達到80%，使用旋渦混合器使其充分混合，4 500 r/min 離心5 min，棄去上清液，重復上述步驟三次得到沉淀，將其放置恒溫干燥箱中低溫（40 ℃）烘干，殘渣用水溶解并定容到500 mL，備用。

(2) 樣品多糖含量的測定。參照的黃承敏等[13]方法，采用苯酚-硫酸法測定發酵乳中多糖的含量。

1.3.6 發酵乳風味成分的測定

采用固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術（SPME-GC-MS）對1.3.2 -（2）中制備的發酵乳進行風味成分分析。

（1）樣品萃取方法。稱取按1.3.1-（2）所制備發酵劑組、復合組和XN1904E 組發酵乳樣品各1 g，分別置于15 mL 萃取瓶，在50 ℃溫度條件下處理30 min,在70 ℃條件下用老化好的萃取頭頂空吸附45 min，再插入GC-MS 進樣口解吸1 min，拔出萃取頭進行GC-MS分析。

（2）GC 條件。 DB-WAX 毛細管色譜柱（30 m 色譜柱（行萃取，0.25 μm）；進樣口溫度為250 ℃；柱箱升溫程序：初溫35 ℃保持3 min，然后以3 ℃/min 的速度升溫至200 ℃，再以20 ℃/min 的速度升溫至最終溫度250 ℃，保持5 min；載氣為氦氣He，流速為1 mL/min；進樣采用自動分流方式進行，分流比10:1[12]。

（3）MS 條件。EM 電離源，離子源溫度為250 ℃；接口溫度為200 ℃；檢測電壓為1kV；質量掃描范圍m/z為35～400。

1.4 數據統計

采用Excel 2010 軟件進行數據分析，顯著水平P＜0.05，并以Origin Pro 2018統計軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 發酵特性測定結果

2.1.1 發酵乳pH 值的測定結果

三組發酵牛乳的pH 變化情況見圖1。三組發酵乳起始pH 基本相同，均在6.50 左右。在發酵過程中，發酵劑組和復配組發酵乳樣品的pH 值均隨著時間的延長顯著下降（P＜0.05），9 h 時發酵劑組和復配組的pH 分別達到了4.275、4.316。pH 值均降至4.5 以下，達到發酵酸乳生產的最終pH 值的要求[16]。9 h 之后發酵劑組和復配組發酵乳樣品的pH 值呈緩慢下降趨勢。XN1904E 單獨發酵組在發酵9 h 時的pH 值6.193 ，此時XN1904E 單獨發酵組的酸乳未能達到酸乳的國家標準，說明植物乳桿菌XN1904E 在發酵前期產酸能力弱。然而隨著后熟時間的延長，XN1904E發酵乳呈顯著下降趨勢，說明植物乳桿菌XN1904E在后熟階段產酸能力增強，可能是發酵前期植物乳桿菌XN1904E 生長繁殖緩慢導致分泌的有機酸較少。

圖1 發酵乳發酵過程中pH值的變化

2.1.2 發酵乳滴定酸的測定結果

滴定酸度能夠反映發酵乳中的酸性物質可能產生的全部氫離子的總量，因此，研究滴定酸度可更好的了解不同發酵條件下的發酵乳的產酸情況[14]。由圖2 可知，滴定酸度與pH 值的結果一致，發酵9 h 后發酵劑組和復配組發酵乳樣品的滴定酸分別為77.731oT、79.085oT ，此時兩組的滴定酸度都超過了70oT，均達到乳酸菌發酵乳生產的最終酸度要求[16]，而此時菌株XN1904E 單獨發酵的酸度僅為24.889oT。且24 h時，復配組發酵乳樣品的滴定酸比發酵劑組高7.4%，可能是植物乳桿菌XN1904E 產生胞外多糖可促進直投式發酵劑利用糖類轉化為有機酸[15]。

圖2 發酵乳發酵過程中滴定酸的變化

2.1.3 發酵乳黏度的測定結果

各發酵乳的黏度測定結果見圖3。，在發酵過程中，0～3 h 三個組別的發酵乳樣品的黏度無顯著變化，可能是發酵前期，菌種的生長速率較慢，導致發酵前期發酵乳的黏度沒有變化；在3～12 h 過程中，發酵劑組和復配組發酵乳樣品的黏度迅速上升，且XN1904E 組發酵乳樣品的黏度仍維持不變，此發酵階段（3～12 h）植物乳桿菌XN1904E 單獨發酵組r仍未出現凝乳現象，說明在發酵前期植物乳桿菌XN1904E單獨發酵的凝乳效果較差。而在12～24 h 過程中，XN1904E 組發酵乳樣品的黏度呈顯著上升趨勢（P＜0.05），又復配組發酵乳樣品的黏度比發酵劑組高13.6%，復配組黏度最大高達18320.000 mPa·s。可能是因為植物乳桿菌XN1904E 后期迅速繁殖，其產生胞外多糖增加發酵乳的黏度[17]。

圖3 發酵乳發酵過程中黏度的變化

2.2 植物乳桿菌（XN1904E）發酵乳多糖含量的結果

各發酵乳的多糖含量測定結果見圖4。由圖4 可知，發酵劑組、XN1904E組和復配組三組發酵前脫脂乳中多糖含量分別為378.542 μg/mL、626.167 μg/mL、370.127 μg/mL。在發酵完成后，發酵劑組發酵乳樣品中的多糖含量下降了90.873 μg/mL，XN1904E 組和復配組發酵乳中多糖含量分別上升了180.617 μg/mL、46.288 μg/mL。加入菌株XN1904E 后，發酵乳中的多糖含量明顯增加，此結果與添加菌株XN1904E 后黏度顯著上升相結合，說明植物乳桿菌XN1904E 迅速繁殖，產生大量的胞外多糖可以改善發酵乳的黏度和組織結構，減少乳清析出[18]。

圖4 植物乳桿菌（XN1904E）對發酵乳產糖含量的影響

2.3 植物乳桿菌（XN1904E）發酵乳風味成分的結果

各發酵牛乳組的揮發性成分測定結果見表1。由表1的結果可知，發酵乳的風味成分種類繁多。復配組發酵乳共有揮發性成分35種，其中醛類9種，酮類6種，烷烴類6種只來5種，醇類6種，其他3種。發酵劑組發酵乳共測得揮發性成分29種，其中醛類8種，酮類4種，烷烴類6 種，酯類4 種，醇類4 種，其他3 種。XN1904E組發酵乳測得揮發性成分30種，其中醛類10種，酮類3種，烷烴類6種，酯類3種，醇類4種，其他4種。

（1）醛類化合物。醛類化合物在酸奶發酵過程中屬于過渡態化合物，會被迅速還原生成伯醇或被氧化生成相應的酸[19]。從表1 中可以看出，發酵前，發酵劑組和復配組的醛類物質基本相同，主要物質有壬醛、癸醛、2-甲基烯醛、正十五碳醛、十六醛、2,4-二甲基苯甲醛，XN1904E 組只有壬醛、癸醛、庚醛三種醛類物質。壬醛主要來自于不飽和脂肪酸，是由中間態的過氧化物產生的，具有玫瑰、柑橘等香氣[20]。發酵24 h后，三組醛類風味物質種類明顯增加，尤其是XN1904E 組醛類物質增加到10 種，且壬醛、癸醛、十六醛、2,4-二甲基苯甲醛相對含量分別13.259%、13.684%、21.952%、2.474%。與發酵前脫脂乳相比，更加豐富了發酵乳的香味。

（2）酮類化合物。酮類酮類化合物風味獨特，閾值低，乳制品中最重要的揮發性物質是甲基酮類物質，它們會賦予發酵乳奶水果、花香等香氣風味物質[21]。發酵前，發酵劑組和復配組酮類物質基本相似，且XN1904E 組酮類物質只有2,3-庚烷二酮，且相對含量只有0.322%。發酵后，發酵劑組的酮類物質種類無變化，而復配組和XN1904E 組的酮類物質明顯增多。這可能是植物乳桿菌XN1904E 發酵后代謝產生[22]。

（3）酯類化合物。酯類化合物是一種很重要的風味物質，脂肪是酸奶酯類的主要來源，主要是通過脂肪酸水解和微生物代謝產生, 尤其是中短鏈脂肪酸水解產生的甲基酮和內酯對酸奶風味產生影響[23]。發酵前，發酵劑組、復配組和XN1904E 組都只檢測出一種酯類為鄰苯二甲酸二丁酯。發酵后，復配組的酯類物質增加到5 種，分別為苯乙醇乙酸酯、鄰苯二甲酸酯、順式-3-己烯醇2-甲基丁酸酯、二十六烷酸甲酯、鄰苯二甲酸二丁酯。發酵劑組的酯類物質增加到4 種，XN1904E 組也有三種，這可能是微生物代謝產生。

（4）醇類化合物。醇類化合物是乳品中比較普遍存在的風味物質，它主要是由脂肪酸氧化酶作用于多不飽和脂肪酸衍生而來的[24]。醇類物質雖然對風味貢獻不大，但是醇類可以轉化胃酸。發酵前，脫脂乳中都沒有醇類化合物。發酵后，三組醇類化合物都有所增加，豐富的醇類物質使發酵酸奶能表現出典型的醇香味。

表1 不同樣品中揮發性成分

（續表1）

3 結 論

對發酵劑組、復合組和XN1904E 組的pH、滴定酸、黏度、多糖含量和風味成分進行測定，發酵乳的pH 和滴定酸的結果基本一致，發酵劑組、復合組在發酵9 h 后，pH 分別為4.275、4.316；發酵劑組、復合組在發酵9 h 后，滴定酸分別為77.731oT、79.085oT，但XN1904E 組的pH 和滴定酸都未能達到發酵乳的要求[16]，說明植物乳桿菌XN1904E在發酵前期產酸能力不強；又復配組發酵乳樣品的黏度明顯高于發酵劑組和XN1904E 組，復配組黏度最大高達18320.000 mPa·s。發酵劑組發酵乳樣品中的多糖含量下降了90.873 μg/mL，XN1904E 組和復配組發酵乳中多糖含量分別上升了180.617 μg/mL、46.288 μg/mL，說明植物乳桿菌XN1904E 產生的胞外多糖對發酵乳的黏度有很大的影響。與發酵前脫脂乳相比，復合組風味物質的種類增加至35 種，分別比發酵劑組和XN1904E 組多6 種和4種，醛類物質的相對含量減少了15.793%，而酮類、烴類、酯類和醇類風味物質的相對含量都有所增加，更加豐富了發酵乳的香味。