檸檬酸鈉輔助谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶對(duì)牦牛乳凝膠特性的研究

李趙敏，楊林，張輝,辜雪冬，祝亞輝

(西藏農(nóng)牧學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院食品科學(xué)與工程重點(diǎn)自治區(qū)實(shí)驗(yàn)室，西藏林芝860000)

0 引 言

牦牛乳酸奶以其獨(dú)特的風(fēng)味、細(xì)膩的口感和較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值而深受人們的青睞。與市售荷斯坦牛乳形成的酸奶相比，牦牛乳酸奶的致敏性更低，蛋白質(zhì)、礦質(zhì)元素、維生素和不飽和脂肪酸含量更高，具有廣闊的市場(chǎng)前景[1]。據(jù)報(bào)道，雖然牦牛的產(chǎn)乳量是傳統(tǒng)奶牛的1/10，但因?yàn)槠涞鞍踪|(zhì)平均含量、脂肪含量和干物質(zhì)含量等高于普通牛乳，所以牦牛酸奶具有更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[3]。牦牛酸奶的構(gòu)筑單元是酪蛋白膠束，包括αs1-酪蛋白，αs2-酪蛋白，β-酪蛋白，κ-酪蛋白[4]。酪蛋白膠束是直徑約在100～300 nm 的膠束，通過(guò)疏水相互作用、蛋白和蛋白之間的靜電相互作用、蛋白和鈣之間的靜電相互作用、氫鍵以及二硫鍵進(jìn)行相互結(jié)合[6]，通過(guò)靜電排斥和空間位阻效應(yīng)穩(wěn)定分散與水中[7]，但是酪蛋白膠束中的共價(jià)鍵貢獻(xiàn)度極小。相比于普通牛奶的酪蛋白膠束，牦牛乳的酪蛋白膠束更大，而大顆粒的聚集更容易產(chǎn)生多而大的空隙，形成的凝膠不均一，更易出現(xiàn)凝膠不穩(wěn)定現(xiàn)象[8]。因此如何改善牦牛酸奶的質(zhì)構(gòu)特性是行業(yè)亟待解決的問(wèn)題。

研究表明，共價(jià)鍵的引入增強(qiáng)酸奶凝膠強(qiáng)度可以改善牦牛乳凝膠質(zhì)構(gòu)缺陷，谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶能催化蛋白質(zhì)間（或內(nèi)）的酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，增加酸奶的凝膠強(qiáng)度和持水性[9-10]。據(jù)報(bào)道，由MTGase 處理的膠束酪蛋白制備的酸誘導(dǎo)凝膠的質(zhì)地特性可以顯著提高，但上述凝膠結(jié)構(gòu)缺陷仍未完全解決[11-12]。由于牛乳的酪蛋白膠束粒徑較大，比表面積小，MTGase 的交聯(lián)位點(diǎn)有限，即使經(jīng)過(guò)MTGase 處理后的牦牛乳凝膠結(jié)構(gòu)仍然不均且很脆弱[13]。向酪蛋白膠束中添加鈣離子螯合劑可將天然酪蛋白膠束分解成更小的亞微膠粒[14]。這可改變凝膠形成過(guò)程中酪蛋白顆粒的重排和MTGase 與酪蛋白之間的接觸，將在酸化之前或酸化過(guò)程中改變酪蛋白分子之間的交聯(lián)鍵，在MTGase 作用前使更多的位點(diǎn)暴露出來(lái)，有利于下一步的結(jié)合[15]。且已有研究證實(shí)，TSC 可使酪蛋白膠束解離形成小的亞膠束，可能改變MTGase 交聯(lián)位點(diǎn)的個(gè)數(shù)，從而影響凝膠的強(qiáng)度和持水力[16]。但是目前尚無(wú)TSC 輔助MTGase 處理對(duì)牦牛乳凝膠性質(zhì)影響的研究報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)的目的是研究鈣離子螯合劑TSC 協(xié)同MTGase 對(duì)脫脂牦牛乳進(jìn)行處理，再經(jīng)過(guò)酸化之后進(jìn)行凝膠穩(wěn)定性的測(cè)定，并進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，研究其對(duì)酪蛋白膠束凝膠結(jié)構(gòu)特性和微觀特性的影響，及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牦牛奶，購(gòu)于甘肅省合作市瑪曲牦牛養(yǎng)殖農(nóng)戶；二水合檸檬酸三鈉（TSC）（分析純），上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶（MTGase，上海道衍商貿(mào)有限公司；D-葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯（GDL），Sigma-Alorich貿(mào)易有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME2002 電子天平：梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司；動(dòng)態(tài)光散射儀，英國(guó)Malvern 公司；TMS-Pro 型質(zhì)構(gòu)儀，美國(guó)FTC 公司；分析天平（萬(wàn)分之一），美國(guó)Denver 公司；HW-W2·600 型智能恒溫水浴箱，北京東方精銳科技發(fā)展有限公司；TDL-608低速臺(tái)式大容量離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；Thermo 低溫高速離心機(jī)，大連博凱輝創(chuàng)科技有限公司；THZ-22 臺(tái)式恒溫振蕩器：北京科爾德科貿(mào)有限公司；流變儀，美國(guó)TA 公司，HJ-6A 型數(shù)顯恒溫多頭磁力攪拌器，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 牦牛酸奶的制備

1.3.1.1 牦牛酸奶的工藝流程

鮮奶→脫脂→加入檸檬酸三鈉→磁力攪拌（20 ℃，20 min）→調(diào)節(jié)pH（6.55—6.65）→加入MTGase 酶→磁力攪拌（20 ℃，20 min）→水浴加熱（42 ℃，2 h）→加入葡萄糖酸內(nèi)脂→磁力攪拌（20 ℃，20 min）→水浴加熱（42 ℃，4 h）

1.3.1.2 原料牛乳的處理

對(duì)牦牛乳進(jìn)行低溫離心處理（4 500 r，4 ℃，30 min），去除上層脂肪及其他雜質(zhì)，置于4 ℃冷藏條件下備用。

1.3.1.3 MTGase酶分散體的制備

將一定量的MTGase 酶分散在超純水中，于25 ℃600 rpm 磁力攪拌30 min。將分散液在25 ℃下以3 000 r 離心10 min 以除去底部的雜質(zhì)，使用前4 ℃冷藏備用。

1.3.1.4 酸化劑的用量

新鮮牦牛乳經(jīng)過(guò)脫脂處理后，取100 mL（四份）于燒杯中，依次加入TSC、MTGase 進(jìn)行處理，攪拌后調(diào)節(jié)pH，然后分別加入0、10、30、50 mmol/L 的GDL，每份均分為三份，分別加入1.2%，1.4%，1.6%的GDL，42 ℃水浴4 h后，用玻璃棒攪拌破壞凝膠結(jié)構(gòu)，再使用pH 計(jì)測(cè)定pH。

表1 不同GDL添加量下樣品pH值

測(cè)定結(jié)果如表1 所示，當(dāng)GDL 的添加量為1.4%時(shí)，牦牛乳凝乳后的pH 與市售牦牛酸奶的pH 最為相近，故確定最終添加的葡萄糖酸內(nèi)酯的含量為1.4%（w/v）（以奶計(jì)）。

1.3.1.5 牦牛乳凝膠樣品的制備

向牦牛乳中緩慢加入TSC（置于磁力攪拌器上連續(xù)攪拌），使其濃度分別為0、10、30、和50 mmol/L。用0.5 mol/L 的乳酸調(diào)節(jié)pH 至6.55～6.65，然后加入一定體積的MTGase 分散液，使其酶活為10 U/g 乳蛋白，在42 ℃的水浴中放置2 h，然后添加1.4% GDL 后繼續(xù)在42 ℃下水浴4 h后進(jìn)行凝乳特性的測(cè)定。

1.3.2 試驗(yàn)思路

為了探究TSC 和MTGase 的協(xié)同作用，分別設(shè)置以下三個(gè)處理組：

處理組1 的試劑加入順序：檸檬酸三鈉、MTGase、

GDL；

處理組2 的試劑加入順序：MTGase、檸檬酸三鈉、

GD；

處理組3的試劑加入順序：檸檬酸三鈉、GDL。

圖1 不同的凝膠制備方式示意圖

1.3.3 酸奶品質(zhì)測(cè)定方法

1.3.3.1 粒徑的測(cè)量

將加入MTGase 后經(jīng)過(guò)磁力攪拌的樣品用移液槍取液125 uL 于25 mL 容量瓶中，用去離子水定容，震蕩20 min。Malvern 動(dòng)態(tài)光散射儀預(yù)熱30 min 后進(jìn)行測(cè)量，設(shè)置測(cè)試溫度20 ℃，分散介質(zhì)的折光指數(shù)為1.33。

1.3.3.2 質(zhì)構(gòu)特性的測(cè)定

取樣品20 mL 于質(zhì)構(gòu)儀專(zhuān)用樣品杯中按照2.3.1.4操作進(jìn)行凝乳，從水浴鍋取出后恢復(fù)至室溫，置于質(zhì)構(gòu)儀上測(cè)其硬度，平行做6 個(gè)樣品。利用TMS-Pro 質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定酸奶質(zhì)構(gòu)特性，選擇20 mm 探頭，每測(cè)一次將探頭清洗干凈后擦干再測(cè)下一個(gè)樣品。測(cè)定參數(shù)為：最大量程100 N，觸發(fā)力0.05 N，檢測(cè)速度30 mm/min，穿刺距離10 mm，回程速度60 mm/min，回程距離10 mm。

1.3.3.3 持水力的測(cè)定

測(cè)量離心管的質(zhì)量并記錄W0，取7 mL 加入GDL后的樣品置于離心管中，水浴加熱4 h，并測(cè)定樣品質(zhì)量W1，以4 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心10 min，取出后在室溫下靜置10 min,除去上清液，測(cè)量殘余物質(zhì)量W2，酸奶持水力的計(jì)算公式如下:

1.3.3.4 流變性測(cè)定

使用流變儀進(jìn)行流變性能的測(cè)量，選擇同心圓柱體夾具（外徑15 mm，內(nèi)徑14 mm），每次進(jìn)樣量20 mL，振動(dòng)應(yīng)力范圍為0～100 Pa，頻率為1 HZ，取樣點(diǎn)設(shè)置為每個(gè)數(shù)量級(jí)取樣20次。

1.3.3.5 pH 的測(cè)定

取經(jīng)過(guò)按照2.3.1.4 處理的凝乳樣品，攪拌均勻，用PHS-25 型實(shí)驗(yàn)室pH 計(jì)依次測(cè)定各樣品的pH 值并記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度TSC 對(duì)凝膠質(zhì)構(gòu)的影響

質(zhì)構(gòu)儀測(cè)量指標(biāo)包括硬度、粘性、彈性等，獲得的質(zhì)構(gòu)參數(shù)或者指標(biāo)能夠很好的反映食品的口感或者質(zhì)構(gòu)，牦牛酸奶的硬度是直接反應(yīng)口感的一項(xiàng)指標(biāo)，易于觀察，且粘著性的絕對(duì)值與硬度幾乎呈正相關(guān)[17]，故本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析硬度來(lái)評(píng)價(jià)牦牛酸奶的質(zhì)構(gòu)特性。

表2 TSC添加量對(duì)于凝膠硬度的影響 N

圖2 不同處理對(duì)樣品硬度的影響

根據(jù)表2 信息，處理組3 的凝膠硬度明顯低于處理組1 和處理組2 的凝膠硬度，說(shuō)明MTGase 的確能有效改善牦牛乳的酪蛋白膠束的結(jié)構(gòu)。在處理組1 中，當(dāng)TSC 添加量達(dá)到50 mmol/L 時(shí)，其硬度反而低于添加量為10 mmol/L 時(shí)的硬度值，可能是因?yàn)楫?dāng)TSC 添加量達(dá)到50 mmol/L 時(shí)，一部分檸檬酸鈉作為鈣離子螯合劑使用，而剩余的檸檬酸鈉則游離在乳中，形成了檸檬酸緩沖體系，緩沖體系有助于防止pH 的下降，加入酸化劑后在相同的反應(yīng)條件下，pH 難以下降到酪蛋白的等電點(diǎn)以下（或剛好接近酪蛋白的等電點(diǎn)），此時(shí)無(wú)法形成凝膠或形成的凝膠極其不穩(wěn)定，所以硬度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于添加量為10或30 mmol/L的樣品。圖2 將處理組1 和處理組2 的硬度值進(jìn)行了對(duì)比，在處理組1 中，當(dāng)TSC 濃度達(dá)到30 mmol/L，硬度值達(dá)4.65± 0.55 N，顯著高于添加量為10 mmol/L 時(shí)的3.12±0.57 N和添加量為50 mmol/ L時(shí)的2.50±0.29 N；在處理組2 中，隨著TSC 添加量的增加，牦牛乳凝膠的硬度反而降低，究其原因可能是因?yàn)橄燃尤氲腗TGase 使酪蛋白膠束之間發(fā)生了共價(jià)交聯(lián)，但是在此之后加入的TSC 又破壞了酪蛋白膠束的凝膠結(jié)構(gòu)，使酪蛋白膠束內(nèi)部和兩個(gè)膠束之間的Ca2+被奪走，不僅破壞了此前形成的共價(jià)鍵，可能還使酪蛋白膠束本身的結(jié)構(gòu)被破壞，從而導(dǎo)致牛乳的硬度下降，不添加TSC的樣品硬度為2.65±0.23 N，遠(yuǎn)高于添加TSC 的樣品，樣品中加入的TSC 的含量越多，被破壞的膠束越多，牦牛酸乳的硬度越差。這表明，先加入TSC 的確能夠提高牦牛乳凝膠的硬度，且TSC 處理對(duì)牦牛乳凝膠硬度有顯著影響。

2.2 不同濃度TSC 對(duì)膠束持水力的影響

圖3 不同濃度TSC對(duì)膠束持水力的影響

TSC 對(duì)酸誘導(dǎo)的牦牛乳凝膠的持水力的影響見(jiàn)圖3。當(dāng)TSC 濃度達(dá)到10 mmol/L 后，持水能力即高于90%，顯著高于0 mmol/L（空白組，持水力49.71±0.3%）。這表明，TSC 輔助MTGase 處理脫脂牦牛乳后，能夠提高牦牛乳凝膠的持水力，這與凝膠的堅(jiān)硬程度有關(guān)，因?yàn)槿跄z傾向于流動(dòng)，導(dǎo)致凝膠易收縮和乳清排出。

2.3 不同濃度檸檬酸三鈉對(duì)膠束流變性能的影響

食品流變是指食品在力的作用下發(fā)生形變，測(cè)定食品的流變性對(duì)于鑒別、控制食品的質(zhì)量、設(shè)計(jì)、改善有關(guān)加工設(shè)備具有重要的意義。酸乳是一種復(fù)雜的流體，其流變性是指酸奶的流動(dòng)和變形隨時(shí)間和力的變化而表現(xiàn)出的性質(zhì)，酸乳的流變性通常用來(lái)描述和衡量產(chǎn)品的質(zhì)地，包括凝膠的黏度、硬度等[18]。圖4 顯示了牦牛酸乳在0～100 Pa 的壓力下應(yīng)力掃描的結(jié)果，其中tanδ 指G”（黏性模量）和G'（彈性模量）的比值,當(dāng)tanδ=1 時(shí)，表示酸乳處于固液臨界點(diǎn)，即凝膠狀態(tài)即將被破壞。由圖可知，在添加量為0、10、30 mmol/L的三個(gè)樣品中，隨著檸檬酸鈉添加量的增加，達(dá)到tanδ=1 時(shí)的壓力也不斷增加，即破壞掉凝膠結(jié)構(gòu)所需要的力逐漸增加，直接證明了經(jīng)過(guò)TSC 和MTGase處理后，牦牛酸乳的凝膠性能得到了大幅度提升，當(dāng)TSC 添加量為為30 mmol/L 時(shí)，其凝膠性能是不添加TSC 時(shí)的2倍左右。

圖4 不同濃度TSC對(duì)膠束流變性能的影響

2.4 不同TSC 添加量對(duì)酪蛋白粒徑的影響

正常的牦牛奶酪蛋白膠束的直徑約在100～300 nm，相比于普通奶牛酪蛋白的直徑，牦牛奶酪蛋白的膠束更大，TSC 可使酪蛋白膠束解離形成小的亞膠束，可能改變MTGase 交聯(lián)位點(diǎn)的個(gè)數(shù)，從而影響凝膠的強(qiáng)度和持水力，為了探究經(jīng)過(guò)TSC處理以后的酪蛋白膠束的直徑是否發(fā)生了改變，將TSC 分別按照0 mmol/L、10 mmol/L、30 mmol/L、50 mmol/L 的濃度添加到適量脫脂奶中，攪拌均勻后加入MTGase，再次攪拌均勻，用移液槍取液125 uL 于25 mL 容量瓶中，用去離子水定容，測(cè)量粒徑。

圖5 不同TSC對(duì)酪蛋白粒徑的影響

TSC 協(xié)同MTGase 處理的牦牛乳酪蛋白膠束尺寸的影響見(jiàn)圖5。隨著TSC 濃度的增加，顆粒的平均直徑呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，未添加檸檬酸鈉的樣品，粒徑在100～400 nm 之間，而添加檸檬酸鈉50 mmol/L 的樣品，粒徑分布在20～50 nm 之間。結(jié)果表明凝乳分散體中的酪蛋白膠束的粒徑隨著TSC 濃度的增加而降低。有研究已證明，鈣離子螯合劑可以通過(guò)從膠束中去除Ca2+來(lái)破壞酪蛋白膠束框架，導(dǎo)致酪蛋白膠束的解離，使大顆粒的膠束分解成小顆粒的亞結(jié)構(gòu)，因此檸檬酸根離子會(huì)降低酪蛋白膠束的粒徑。酪蛋白顆粒的粒徑越小，其比表面積越大，暴露出更多的酶結(jié)合位點(diǎn)，易于MTGase 的結(jié)合，理論上MTGase 對(duì)其交聯(lián)的效率越高，形成的凝膠強(qiáng)度越大。

2.5 酪蛋白膠束的重組

相對(duì)于其他研究中直接添加MTGase，本實(shí)驗(yàn)先經(jīng)過(guò)TSC 處理的優(yōu)勢(shì)如圖6所示。

圖6 檸檬酸鈉作用示意圖

酪蛋白膠束直接經(jīng)過(guò)MTGase 處理后，雖然形成了相應(yīng)共價(jià)鍵，但是其凝膠結(jié)構(gòu)并未被打開(kāi)，只在膠束之間形成了共價(jià)鍵，形成的共價(jià)鍵數(shù)量少，在后期的酸凝過(guò)程中，膠束之間的結(jié)合仍然較為松散，凝膠性弱；在經(jīng)過(guò)TSC 處理后，酪蛋白膠束之間的非共價(jià)鍵作用被破壞，酪蛋白單體釋放，暴露出更多的酶結(jié)合位點(diǎn)，此時(shí)再經(jīng)過(guò)MTGase 處理后，形成了更多的共價(jià)鍵，經(jīng)過(guò)酸凝處理后，形成了致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，其持水力和凝膠穩(wěn)定性大幅度提高。

3 結(jié) 論

在本研究中，研究了TSC 對(duì)酸誘導(dǎo)的MTGase 處理的膠束酪蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)特性和微觀結(jié)構(gòu)的影響。得出結(jié)論：TSC 能螯合酪蛋白膠束中的Ca2+，破壞天然的酪蛋白膠束，使天然酪蛋白膠束分解成較小的酪蛋白亞微膠粒，交聯(lián)位點(diǎn)暴露，有利于MTGase 對(duì)其進(jìn)行重新組合，經(jīng)過(guò)酸凝后形成的凝膠比直接用MTGase 形成的凝膠更穩(wěn)定。酪蛋白膠束首先被TSC解離，然后與MTGase 交聯(lián)（處理組1）比先用MTGase交聯(lián)，再用TSC 處理（處理組2）更能形成穩(wěn)定的酸性凝膠。因此，當(dāng)TSC 將牦牛乳酪蛋白膠束分解成更小的顆粒后，再經(jīng)過(guò)MTGase 處理和酸誘導(dǎo)形成的凝膠，將具有更高的硬度，形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)均勻且致密，因此持水能力有很大提升，并且在一定范圍內(nèi)（0～30 mmol/L），TSC 濃度越大，形成的凝膠越強(qiáng)，持水能力越好。