基于BIOLOG技術分析氮沉降和降水對土壤微生物功能多樣性的影響

林婉奇,薛 立

華南農業大學林學與風景園林學院, 廣州 510642

氮(N)沉降和降水格局變化是全球氣候變化的兩個重要組成部分[1]。由于生產和生活中大量化石燃料的燃燒和化學肥料的過度使用,過去100年來氮沉降量顯著增加,在亞洲溫暖潮濕的氣候帶尤為明顯[2]。在大多數地區，氮是限制植物生長的主要因子,低速率的氮沉降促進森林的生長[3],而慢性高氮輸入會導致許多不利影響,包括增加溫室氣體排放[4]、養分不平衡[5]及土壤酸化[6]等。目前大多數陸地生態系統的氮沉降量持續增加,預計到2050年,氮沉降速度將是當前的兩倍,氮沉降量將超過生態系統的關鍵負荷量[7]。在全球氣候變化背景下,降水變化通過改變土壤的通透性進而影響陸地生態系統的地下生態過程。據預測,高緯度地區降水量將增加,大多數亞熱帶地區降水量將減少[4]。降水能增加土壤濕度,有助于氮肥肥效的發揮。同時,氮沉降和降水的變化會引起土壤微生物群落結構和功能多樣性的改變,并對生物地球化學循環和氣候―生態系統反饋產生連鎖效應[8]。

土壤微生物是許多關鍵生態系統變化的重要驅動力,在維持生態系統功能和服務中起關鍵作用[9]。土壤微生物多樣性是土壤質量變化的重要指標[10]。國內外關于土壤微生物多樣性的研究集中在物種、功能、結構及遺傳多樣性四個方面[11]。其研究方法也在不斷的改進,主要包括磷脂脂肪酸法(PLFA)[12-14]、BIOLOG 微量分析法[7, 15]、變性梯度凝膠電泳技術(DGGE)[16-17]和高通量測序技術[18-20]等。其中,BIOLOG技術以群落水平碳源利用類型為基礎的BIOLOG氧化還原技術為研究土壤微生物群落功能多樣性提供了一種簡單、快速的方法,并得以廣泛應用。目前,關于微生物多樣性的研究多側重于物種、結構和遺傳三個方面,對功能多樣性研究相對較少。土壤微生物功能多樣性是指土壤微生物群落所能執行的功能范圍以及這些功能的執行過程,對于明確不同環境中微生物群落的作用具有重要意義[21]。另外,微生物各官能團在決定各種土壤生化反應中亦具有關鍵作用[22]。土壤微生物群落功能多樣性可能受到環境(非生物和生物)因素和人為措施的直接和間接影響[23],其群落組成和功能的變化可能引發一系列反應,如影響凋落物和有機質的分解速率、腐殖質的形成以及養分的轉化和循環,進而影響土壤微生物和植物群落之間的相互作用[15]。

近二十幾年來,用來鑒定細菌在土壤間的功能差異性的BIOLOG技術取得了長足進步[24],BIOLOG分析技術通過微生物對不同碳源的利用特點來直觀反映土壤微生物的功能多樣性而被廣泛應用[25]。目前,缺乏有關氮沉降和降水對土壤微生物功能多樣性影響的綜述,作者對國內外這一研究內容進行總結,可以為全球氣候變化背景下土壤微生物群落功能多樣性的研究提供參考。

1 氮沉降對土壤微生物代謝和碳源利用的影響

全球性的大氣氮沉降日趨嚴重,影響了土壤微生物的分解,進而導致土壤養分有效性的變化[26]。開展土壤微生物多樣性研究技術難度大、方法要求高。國內外關于氮沉降對土壤微生物功能多樣性影響的研究起步較晚,多見于森林[27-29]、草原[15, 30- 31]、濕地[32- 33]等生態系統(表1)。

表1 基于BIOLOG技術分析氮沉降對土壤微生物功能多樣性的影響

1.1 氮沉降對土壤微生物代謝活性的影響

N是土壤中最常見的限制性營養元素,主要通過氮的固定進入生態系統,增加氮沉降可能會改變土壤微生物群落的組成及其對生態系統結構和功能的反饋[34]。BIOLOG板的平均顏色變化率(AWCD)的值越高代表了土壤微生物群落代謝活性越高[35]。氮沉降對土壤微生物代謝活性的影響主要包括以下兩個方面：

(1)促進作用：在氮含量較低的土壤中,會產生氮限制,故施氮有助于緩解氮限制,改善土壤有效氮含量,從而促進土壤微生物的碳代謝功能活性[36]。隋心等[32]和吳松芹等[33]的研究發現,濕地土壤微生物的AWCD值隨著土壤氮含量的增加而逐漸上升,且均高于對照處理。這可能是因為施氮促進了植物的生長,地上較高的生物量會返回土壤,為土壤微生物群落提供充足的碳源,從而促進了微生物的碳代謝活性。植物群落與土壤微生物群落之間的相互作用是眾所周知的。一方面,植物生產力影響土壤微生物群落的功能多樣性[36]；另一方面,土壤微生物功能和群落組成的變化通過影響凋落物和有機物分解速率、腐殖質形成、營養轉化和循環,進一步改變植物群落和微生物群落之間的相互作用[15]。因此氮沉降對土壤微生物代謝活性的影響還需要進一步深入研究。

(2)抑制作用：過量的氮沉降產生的土壤酸化以及鋁毒效應將導致土壤對微生物群落的脅迫程度加深,改變了微生物的群落結構,進而抑制了土壤微生物類群(細菌、真菌和原生動物等)的代謝活性[15,29,37- 38]。在新西蘭漢密爾頓附近的兩個牧草試驗點的研究表明,長期施氮降低了土壤微生物的AWCD值,抑制了其代謝活性[30]。在內蒙古草原樣地,經過連續5a施用氮肥,降低了土壤微生物的AWCD值[31]。蘇丹等[39]的研究也發現,適量施氮促進了桉樹林土壤微生物群落的代謝活性,但過量的氮沉降會對其產生抑制作用。

1.2 氮沉降對土壤微生物碳源利用的影響

微生物利用碳源的特點是一個非常重要的表征特性,關系到微生物種群之間的生長繁殖和生存競爭,曾用于微生物的數值分類,也被稱為微生物的“新陳代謝指紋冶[40]。大多數土壤微生物是異養型生物,通過對碳源的利用而驅動土壤的功能變化。氮沉降影響土壤養分的有效性,引起微生物對碳源利用的變化,最終改變微生物群落的結構和功能[41]。

目前關于氮沉降條件下土壤微生物對不同類型碳源利用模式的研究還沒有統一定論,這可能是因為微生物群落對土壤環境變化和脅迫高度敏感,導致微生物C利用模式的變化與環境參數的變化有關[42],且不同碳源類型存在不同的官能團,如碳水化合物(R-C=O)、氨基酸(-NH2和-COOH)、羧酸(-COOH)、酚類化合物(-OH)、胺(-NH2)和聚合物(單體)[43]。Frey等[27]報道了高氮處理下硬木林土壤微生物對碳水化合物和羧卻對細菌具有抑制作用酸的相對利用率顯著降低,對檸檬酸和丙二酸的利用率顯著提高。Chakraborty等[41]發現,氮肥的施用降低了土壤微生物群落分解代謝氨基酸和胺類碳源的能力。朱凡等[44]發現,施氮后酵母菌提高了利用羧酸類和聚合類的能力,而對糖類的利用能力下降；土壤厭氧菌對氨基酸類和核苷類碳源的利用能力得到提高,而對羧酸類、糖類和有機酸類的利用能力下降；革蘭氏菌對無機鹽類和羧酸類的利用能力提高,而對糖類、聚合類、其他氨基酸類碳源的利用能力下降。這可能是不同土壤微生物對土壤環境變化的一種適應機制。馬慧君等[45]的研究報道,在高氮處理時楊樹人工林土壤微生物利用酚類碳源的程度最高,在低氮處理時對胺類碳源的利用程度最高。王晶晶等[46]研究氮磷添加對亞熱帶常綠闊葉林表層土壤微生物的影響時發現,隨著氮添加劑量的增加,土壤微生物對酚類和氨基酸類碳源的利用能力明顯提高。

1.3 氮沉降對土壤微生物多樣性指數的影響

McIntosh多樣性指數反映群落物種均勻度；Shannon多樣性指數受微生物群落物種豐富度的敏感影響,反映土壤微生物群落利用碳源程度的變化度和差異度；Simpson多樣性指數可反映土壤微生物群落對常見碳源的利用程度[46]。不同多樣性指數可反映土壤微生物群落功能多樣性的不同側面。施肥時間和施肥量對土壤微生物多樣性指數產生重要影響。氮沉降適量時能提高土壤微生物的多樣性指數[32- 33],但大多數研究表明長期高氮沉降會抑制土壤微生物的多樣性[30]。Shen等[38]的研究發現,土壤微生物群落的多樣性指數均隨氮肥添加速率的增加而呈下降趨勢。Yuan[29]的研究發現,低氮處理對土壤微生物的Shannon指數和McIntosh 指數具有促進作用,高氮處理為抑制作用,不同施氮水平對土壤微生物的Simpson 指數無顯著影響。然而,Cui等[47]研究4年氮添加對華東常綠闊葉林土壤細菌群落的變化卻發現,高氮沉降促進了土壤微生物的Shannon指數,對Simpson 指數沒有顯著影響。這可能與植被類型、土壤性質和氣候條件等因素有關。

大多數研究表明,不同的土壤微生物群落對N沉降的響應也可能不同[48-50]。如郁培義等[28]的研究發現,氮添加顯著促進了真菌的豐富度指數,抑制了其優勢度和均勻度指數,而對厭氧菌沒有顯著影響。Wang等[51]的研究亦發現,高氮沉降促進了真菌的豐富度指數,卻對細菌具有抑制作用。朱凡等[44]的實驗卻發現,施氮后厭氧菌、真菌和革蘭氏菌3種微生物的豐富度增加,均勻度和優勢度降低。一方面,氮素富集會導致土壤酸化,造成氮素的轉化和循環失調；另一方面,氮添加能促進喜氮素種群的代謝活性,從而降低土壤微生物群落均勻度和優勢度[44]。總的來說,喜氮的物種更容易在氮沉降條件下生存,而厭氮物種隨著施氮水平的增加則逐漸淪為衰退種[52]。

2 降水對土壤微生物代謝和碳源利用的影響

降水通過加速土壤中養分的溶解而提高土壤養分的有效性,從而對陸地生態系統造成影響[26]。一般來說,降水對土壤微生物群落具有短期和長期影響。降水在短期內形成干濕交替,水的添加可以通過提高水溶性養分含量而影響土壤理化特性和植物的生長,進而改變土壤微生物結構和功能多樣性[53- 64](表2)。目前,缺乏有關長期降水對土壤微生物群落結構和功能影響的研究[65 - 67]。

表2 降水對土壤微生物功能多樣性的短期影響

2.1 降水對土壤微生物代謝活性的影響

降水變化可以強烈影響土壤C儲存,改變陸地生態系統生物地球化學過程的速率,最終可能導致土壤微生物功能多樣性的改變[68]。大多數研究發現水分添加對土壤微生物的代謝活性具有顯著的促進作用[69-71]。如王杰等[55]的研究表明,水分添加處理提高了土壤微生物的AWCD值,增強了微生物的碳源利用率。Li等[72]研究亦發現,降水促進了的土壤微生物代謝活性的AWCD值,主要原因為：(1)水分添加直接影響土壤性質,改變土壤微生物的生理狀況,同時調節土壤酶和土壤理化性質,進而影響微生物組成與活性[73]；(2)水分添加可以提高植物生產力,促進植物根系發育,為土壤能提供更多的有效碳源,微生物對土壤碳源的利用率隨之增加,從而促進了微生物活性[69]。

降雨前土壤含水量對土壤微生物群落多樣性有重要影響。雨前土壤含水量處于近飽和狀態,降水對土壤微生物多樣性具有抑制作用或無顯著影響。李華等[74]研究不同地下滴灌制度下黃瓜土壤的微生物多樣性發現,AWCD值隨著灌水量的增加呈先升后降的趨勢,說明過量的水分添加會抑制土壤微生物的代謝活性。劉亞軍等[75]研究濕地土壤微生物的碳源代謝活性發現,濕潤組土壤微生物代謝活性AWCD值高于淹水組和干燥組,表明濕潤土壤環境的土壤微生物活性高,且干燥比淹水更不利于微生物利用碳源物質進行生長, 說明當土壤水分含量達到過飽和狀態時,水分添加改變土壤酶和土壤理化性質,限制土壤微生物對一些化合物的分解,因而降低了微生物的活性[73]。然而,靳正忠等[76]及Xi和Bloor[77]的研究發現,降水對土壤微生物的碳源代謝能力沒有顯著影響。這可能因為土壤微生物的代謝活性還受植物種特性的影響[78]。

2.2 降水對土壤微生物碳源利用的影響

土壤微生物對不同類型碳源的利用強度可以反映土壤肥力與質量的變化,體現其群落結構在碳素物質轉化和能量流動中的協同與競爭作用[79]。降水變化改變了土壤養分的平衡和有效性,使微生物群落結構變得不穩定。另外,土壤微生物的碳源利用特點與試驗時間長短、生態系統類型、土壤理化性質和土壤基質等多種因素有關,因而呈現出多樣化的響應特征[55]。目前關于不同降水條件下土壤微生物群落對不同類型碳源的利用強度具有不確定性。土壤含水量較低的干旱地帶,降水增加可以促進土壤的酶活性和異養呼吸微生物的生理變化,從而增加底物的可利用性[8]。如Zhang等[8]發現降水促進半干旱草原土壤細菌對氨基酸、碳水化合物、羧酸和聚合物的利用率。Li等[72]的研究表明,降水增減30%促進了土壤微生物對碳水類化合物碳源的利用率,抑制了對胺類碳源的利用率。張超宇等[70]的研究表明,水分添加顯著促進了土壤微生物群落對胺類和酸類的碳源利用率,抑制了對碳水類碳源的利用率。展小云等[78]報道,加水處理促進土壤微生物對胺類的代謝,但未達顯著水平。Xi和Bloor[77]的研究也得出相似的結論。這可能是由于蛋白質聚合的調節、氮礦化以及根系分泌物的數量和質量的變化所致。

2.3 降水對土壤微生物多樣性指數的影響

降水變化可通過直接改變微生物的生存環境和間接影響植物來影響土壤微生物群落[80]。人們普遍認為,微生物本身對環境水分條件的變化具有不同的適應性。微生物細胞壁的特征決定了其對干濕脅迫的適應性。細胞壁厚實、堅固且原生質對環境變化適應性強的微生物類群能較好的適應土壤的水勢變化[81]。Manzoni等[82]的研究發現,真菌對干燥條件的耐受性高于細菌,而革蘭氏陰性細菌對土壤水分變化更敏感。主要原因是適應性策略允許土壤真菌通過其廣泛的菌絲網絡調節滲透壓,使真菌將內部水分和養分轉移到干燥的斑塊上[83]。雖然許多土壤細菌物種具有滲透傳導和滲透調節機制,但是它們需要在土壤表面和土壤聚集體內的局部水膜進行分散和底物擴散,故更容易受到干旱的影響[84]。相關研究表明,水分添加可以顯著增加土壤真菌[85]和革蘭氏陰性菌的相對豐度[62]。

降水通過改變土壤含水量進而影響土壤微生物群落的結構和功能。在水分限制的干旱、半干旱生態系統,降水對土壤微生物多樣性具有正效應；在水分充足的濕生環境中,降水增加對土壤微生物多樣性具有抑制作用或無顯著影響,而降水減少可能通過提高土壤的通透性從而促進了微生物的多樣性。一些關于沙漠的研究表明,降水變化可以顯著促進土壤真菌群落的豐度,從而改變微生物群落的功能動態[62- 63, 66]。Wang等[86]的研究顯示,降水增加和減少均增加了真菌的均勻度和豐富度,而優勢度則反之。張超宇等[70]的研究發現,微生物的豐富度指數隨水分添加量的增加而增加,表明微生物代謝活動對土壤含水量有很強的依賴性。然而,Klimek[87]的研究發現,水分增加抑制了土壤細菌的豐富度和均勻度指數。王楠楠等[71]的研究表明,降水增減30%對微生物多樣性指數無顯著影響。這可能是因為植物的生長效應可能會掩蓋降水帶來的影響,因為降水提高了土壤含水量和有機質含量,但植物的生長及其蒸騰作用的加強反過來又會降低土壤含水量,造成降水對土壤微生物碳源利用能力與對照的差異不顯著。

3 水氮交互作用對土壤微生物功能多樣性的影響

水和氮是生態系統中常發生耦合的兩個因子。首先,N的遷移率和有效性取決于水,降水變化改變了土壤的通透性,對土壤N的硝化和反硝化階段具有重要的調節作用。其次,土壤N的添加可以通過提高葉片葉綠素含量和Robisco酶的活性來提高植物的光合能力,同時促進了植物的蒸騰作用,導致根系區土壤水分的迅速喪失[88]。第三,N的添加可能會提高植物的生產力,增加植被冠層的光截獲并降低土壤表面的蒸發速率[89]。因此,水和氮的交互作用對土壤微生物群落的影響比較復雜,主要有促進作用、拮抗作用、無顯著影響3種觀點(表3)。

表3 水氮交互作用對土壤微生物功能多樣性的影響

(1)促進作用。畢捷等[90]的研究發現,單獨施氮和單獨增加水分對微生物群落的碳源利用的影響均不顯著,而水氮交互作用顯著提高了土壤微生物碳源利用效率。他們在貝加爾針茅草原上,連續兩年的水分與氮素添加處理發現,土壤微生物群落的C源利用率對水氮交互作用比單獨添加N或水更敏感[91]。(2)拮抗作用。水分添加能夠減少氮肥對微生物的抑制作用,水分與氮素添加處理改變了微生物的碳源利用模式和功能多樣性。Sun等[7]的研究發現,水和氮添加對土壤微生物群落具有拮抗作用。在2012年,N添加可能誘導和擴大水處理的效果,而添加水可能抵消微生物底物利用率對N添加的負效應。水和N之間的單側正/負相互作用共同影響微生物的底物利用率,這與以上的雙側正相互作用的結論形成對比。此外,在2011年水與氮之間沒有存在任何相互作用,這表明水和氮的相互作用對土壤微生物對底物利用率的影響可能僅發生在某些氣候條件下,例如在高降雨量的氣候條件下。(3)無顯著影響。Xi等[77]研究一個模范草原社區的戶外中型實驗中發現,水氮的交互作用對細菌的多樣性和碳源利用率均沒有顯著影響。當所研究的生態系統已達到氮飽和狀態,或氮沉降速率遠遠低于氮礦化和硝化速率,且水分條件充足,此時少量施氮只是增加很少一部分必需元素,故對系統影響不大。

4 展望

在全球氣候變化背景下,氮沉降和降水對土壤微生物的影響日益受到關注。然而,因受微生物種類繁多、土壤系統復雜、生態系統成分間聯系復雜和實驗水平等因素的影響,關于氮沉降或降水對土壤微生物功能多樣性影響的研究尚不完善,特別是有關水氮交互作用下土壤微生物功能多樣性的研究十分有限,且利用BIOLOG技術分析土壤微生物功能多樣性存在一定的弊端,因此,今后應加強以下內容的研究：

(1)加強有關水氮交互作用下土壤微生物功能多樣性的研究。

(2)簡化和完善土壤微生物BIOLOG測定程序,降低生產成本和使用成本。由于BIOLOG微孔板的價格較為昂貴,難以普遍應用。應通過持續減少多余的碳源,騰出更多的空間用于重復,用少量的特征碳源代替繁多的碳源來反映土壤微生物群落的變化,可以避免冗余數據的提取和計算,較大程度地減少工作量。

(3)結合多種研究方法,以期全面準確地反映土壤微生物的功能多樣性。目前土壤微生物功能多樣性的研究方法存在很多困難和障礙。一方面,BIOLOG分析法只能從代謝特性角度反映微生物功能多樣性,不能反映具體種屬多樣性,只有能夠利用板上碳源的可培養微生物才能被反映出來；另一方面,多種微生物在BIOLOG微孔板的孔中混合培養后,產生的協同效應或措抗效應會導致微孔板內最終顯示的顏色不一定是各種微生物單獨產生顏色的簡單總和。高通量測序技術提供了更加詳細的微生物群落描述,被證明是微生物生態學研究中一個非常強大的技術。因此,想要全面準確反映土壤微生物的功能多樣性,還需利用高通量測序技術對微生物群落結構和微生物對環境變化的反應進行全面分析,提高我們在自然生態系統或管理生態系統中生物地球化學循環的認識。

(4)短期和長期實驗相結合,更科學和全面地探討土壤微生物功能多樣性對氣候變化的響應機制。目前有關土壤微生物功能多樣性的研究主要集中在短期試驗,研究結果可以反映出微生物對氮沉降和降水的應激效應,但是受到當時氣候條件的影響。在長期試驗中,土壤微生物自我調節并逐漸適應變化的環境,可以體現長期氣候變化對土壤微生物的影響。

(5)加強氮沉降和降水條件下地表植物和土壤微生物間相互作用的研究。氮沉降和降水通過促進地表植物生長和增加其凋落物而間接影響土壤微生物群落,后者通過分解凋落物和改變土壤養分而影響前者。目前鮮有氮沉降和降水變化背景下的土壤微生物和地表植物之間相互作用機制的研究。因此,加強兩者關系的研究有助于弄清土壤微生物對全球變化的響應機制。