降低LST培養基滅菌后內置小倒管的氣泡殘留率

曾佳艷 鄧嘉慧 陳美娟 黃璐芳 吳學妍

在食品安全國家標準GB4789- 2016[1]大腸菌群MPN計數法和致瀉大腸埃希氏菌檢測時，所用培養基乳糖膽鹽發酵培養基、乳糖發酵培養基、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST）、煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）等這些需要用小倒管（杜氏管）考察產氣的培養基，經過滅菌后，會有小氣泡未排空而留在小倒管內的現象發生，導致培養基不能使用。考慮到重復滅菌會破壞培養基的有效成分，對于殘留氣泡的此類培養基只能廢棄，這樣的浪費直接造成了檢測成本的增加，同時也增加了檢測人員的工作量。此外大腸菌群MPN計數法大多數都是多管發酵法，用的培養基量大，分裝的培養基管數較多，滅菌后小倒管里的氣泡排不盡，不能實現完全滅菌[2]，會影響檢測結果的準確性。高壓蒸汽滅菌是常用的重要滅菌法，使用該法進行滅菌時需要排出滅菌器中的冷空氣，然后維持一定壓力達預定時間，才能保證滅菌成功[3]。在滅菌過程中，最大限度地排除冷空氣，才能更好地保證滅菌效果。本文從排氣方面因素結合其他影響LST培養基滅菌后內置小倒管的氣泡殘留率的因素作出分析，找出安全有效的方法降低內置小倒管的氣泡殘留率，達到節約檢測成本、減少人員工作量、保證結果準確性的目的。

1. 儀器與試劑

1.1 儀器與材料

LX-B75L型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器（合肥華泰醫療設備有限公司）；BT-300EA蠕動泵（重慶杰恒蠕動泵有限公司）。

1.2 試藥與試劑

月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST）（北京三藥生物科技公司）；實驗用水（二級水）。

1.3 培養基配制和滅菌

取本品35.6g，加1L蒸餾水，加熱溶解，分裝于有倒管的試管中，每管10ml，雙料稱樣量加倍。121℃高壓滅菌15min。

2. 結果與討論

2.1 滅菌鍋的影響

為了考察不同滅菌鍋的性能是否對結果有影響，通過對兩個相同型號的1號鍋和2號鍋進行實驗數據對比，結果發現兩者之間并沒有很大的差異，說明同型號的不同滅菌鍋的性能相對穩定，對結果無影響。

2.2 倒管口徑大小的影響

在分裝培養基時，盡量避免內置的小倒管內有氣泡。在加熱加壓的滅菌過程中，液體培養基沸騰會帶動內置小倒管浮動。在同一立式壓力蒸汽滅菌鍋中，分裝培養基放入同數量的小倒管（管口直徑5.82mm）和大倒管（管口直徑6.80mm）進行滅菌，結果發現兩者之間無明顯差異。

2.3 排氣壓力的影響

本實驗的滅菌條件為：121℃高壓滅菌15min，滅菌過程當鍋內溫度到達100℃時有冷空氣排出，關閉放氣閥，升溫、升壓至0.05MPa，人工排氣10min，重復兩次，升溫升壓滅菌。在其它條件不變的情況下，考察分別在0.03MPa、0.05MPa和0.08MPa壓力排氣對小倒管的氣泡殘留率的影響（見圖1），結果顯示：隨著排氣壓力的增加，小倒管的氣泡殘留率明顯降低。

2.4 排氣時間的影響

在人工排氣壓力為0.05MPa，排氣次數2次的條件下，考察不同的排氣時間5min、10min、15min對小倒管的氣泡殘留率的影響（見圖2），因排氣時間20min過長，會導致滅菌鍋水位不夠而停止滅菌，故不考慮。結果顯示：隨著排氣時間的增加，小倒管的氣泡殘留率明顯降低，15min較10min降低了超過了50%。故在此條件下，選擇排氣時間15min，可獲得比較滿意的結果。

2.5 排氣次數的影響

在人工排氣壓力為0.05MPa，排氣時間10min的條件下，考察不同的排氣次數1次、2次對小倒管的氣泡殘留率的影響（見圖3），由于排氣3次會導致滅菌鍋水位不夠而停止滅菌，故不考慮。結果顯示：隨著排氣次數的增加，小倒管的氣泡殘留率也相應降低。

2.6 滅菌條件優化

通過對以上五個方面因素的探討和分析，發現排氣的壓力、時間和次數對降低LST培養基滅菌后內置小倒管的氣泡殘留率有顯著的影響，因此對滅菌條件進行優化。考察分別在排氣壓力0.03MPa、0.05MPa和0.08MPa，人工排氣15min，排氣2次的滅菌條件下，對小倒管的氣泡殘留率的影響（見表1）。結果表明，三個排氣壓力之間無明顯差異。在確定了人工排氣15min，排氣2次的條件下，排氣壓力的選擇對于降低小倒管的氣泡殘留率的作用較小。考慮到滅菌鍋的壓力與安全問題，最終選擇排氣壓力0.03MPa，人工排氣15min，排氣2次的滅菌排氣方案。

采用以上確認的滅菌排氣方案，進行了20天的實驗（見圖1），結果顯示：LST培養基滅菌后內置小倒管的氣泡殘留率控制在10%以內，已達到預期值。

3. 結論

本文從同型號不同滅菌鍋的性能、倒管口徑大小、排氣壓力、排氣時間和排氣次數等因素考慮，通過比對實驗結果，在單因素變化的條件下，找出排氣壓力、排氣時間和排氣次數為關鍵影響因素，然后優化滅菌條件，考慮到滅菌鍋的壓力與安全問題，最終選擇排氣壓力0.03MPa，人工排氣15min，排氣2次的滅菌排氣方案。

由于不同品牌不同型號的滅菌鍋性能不同，本文的實驗數據和優化方法只限于L立式高壓滅菌鍋。由于考慮到每種培養基的配方不一樣，本文的優化方法也只限于LST培養基，對于其它培養基的滅菌僅供參考。

參考文獻：

[1]中華人民共和國衛生部，中國國家標準化管理委員會.GB4789.1～40-2016食品安全國家標準食品微生物學檢驗[S].北京：中國標準出版社，2016.

[2]黃啟紅、李光宏等。淺談影響內置小倒管培養基滅菌的因素[R] .現代檢驗醫學雜志.2012 （2）：36-37.

[3]唐欣昀、張明、趙海泉等.高壓蒸汽滅菌器中溫度和壓力的關系[Q] .微生物學通報.2003（3）：14.

作者簡介

曾佳艷，中級職稱，主要研究方向為食品藥品微生物檢測及其方法研究