小麥種質資源BJ399抗條銹病基因的分子標記定位

周喜旺，劉鴻燕，王 娜，魏志平，王曉明，張耀輝，岳維云，汪石俊，曹世勤，宋建榮

(1.天水市農業科學研究所，甘肅天水 741001； 2.甘肅省農業科學院植物保護研究所，甘肅蘭州 730070)

小麥條銹病是由專性寄生菌條形柄銹菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)引起的全世界范圍內小麥上的最主要病害，小麥條銹菌新小種的出現是導致小麥品種抗銹性喪失的主要原因[1]。目前，新毒性小種CYR34已成為甘肅省的第一流行小種[2-3]，使甘肅隴南小麥生產上利用的含有Yr10和Yr26基因的抗源或品種抗病性逐漸喪失[4-5]，而新的抗源材料又嚴重缺乏，因此，發掘新抗源并加以有效利用，對控制該區小麥條銹病發生流行及小麥安全生產具有重要意義。

迄今為止，國際上已在82個位點正式命名了85個抗條銹病基因[6](Yr1～Yr82，其中Yr3有3個等位基因，Yr4有2個等位基因)，如Yr65[7]、Yr76[8]、Yr78[9]和Yr80[10]等為近年定位的抗病基因。由于小麥條銹病菌的高度變異性, 許多曾在小麥生產上發揮重大作用的抗病基因已喪失抗性，目前僅有全生育期抗銹基因Yr5、Yr15和Yr61對當前條銹菌流行小種CYR32、CYR33和CYR34具有一定的抗病性[11]，成株期抗銹基因Yr18具有相對持久的抗條銹性[12-13]。分子標記技術的發展，為抗病基因的檢測、標記及定位提供了可能，其中SSR標記由于其位點豐富、操作簡單、重復性好、多為共顯性、實驗成本低等諸多優點[14]，被廣泛應用于小麥抗病基因定位和分子標記輔助育種。

小麥種質資源BJ399是中國農業科學院作物所從歐洲引進的普通小麥品種，農藝性狀優良。在天水市農業科學研究所甘谷試驗站經連續多年田間抗病性鑒定，發現該品種整個生育期對田間自然誘發的條銹病表現免疫至近免疫，對白粉病表現高抗。基于此，本研究利用條銹菌生理小種CYR34對其雜交后代群體進行遺傳分析和抗條銹病基因染色體定位，旨在明確BJ399的抗條銹病遺傳基礎，為該抗源在甘肅隴南地區的有效利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

利用抗條銹病材料BJ399和感病品種銘賢169配制雜交組合，分別獲得F1、F2和BC1代材料，以上材料均由天水市農業科學研究所中梁試驗站提供；供試菌種為生理小種CYR34的單孢菌系，由甘肅省農業科學院植物保護研究所小麥病害課題組提供。

1.2 苗期條銹病抗性鑒定

將試驗材料播于白色塑料缽內，待幼苗長至2葉1心期，采用抖孢子粉法接種條銹菌單孢菌系CYR34，接種后幼苗置于10 ℃黑暗條件下保濕24 h，之后置于溫室(平均溫度12～18 ℃，光照10～12 h/d，光強5 000～8 000 lx)誘導發病，待感病對照品種銘賢169充分發病后，調查親本和后代材料的反應型，反應型記載采用0、0；、 1、 2、3、4共6級標準進行[15]。用卡方測驗進行適合度檢測，以明確BJ399對生理小種CYR34的抗病基因數、互作方式及抗病特點。

1.3 基因組DNA的提取和抗感池的構建

采用改良的CTAB法[16-17]提取兩親本和F2代分離群體單株的基因組DNA。用分離群體分組分析法(bulked segregation analysis，BSA)鑒定與抗病基因連鎖的微衛星標記。根據抗病性鑒定結果，建立抗感池，將10株高抗單株DNA等量混合構成抗病池，10株高感單株DNA等量混合構成感病池。

1.4 SSR分析

小麥SSR引物根據R?der等[18]、Pestsova等[19]、Song等[20]和Somers等[21]報道的序列從https://wheat.pw.usda.gov網站查找并由北京賽百盛公司合成，以抗病親本、感病親本、抗病池、感病池的DNA為模板篩選SSR引物，尋找在抗病親本、抗病池、感病親本、感病池間有多態性的引物，進一步將多態性引物在F2代分離群體中分析驗證，檢測SSR標記與抗病基因的連鎖程度。初步確定抗病基因所在染色體位置后，再選取其所在基因組區域的其他SSR引物進一步篩選多態性。

PCR擴增反應總體系為10 μL，其中5 μL 2×MasterMix(天根生化科技有限公司)、2 μL ddH2O、上下游引物各1 μL、模板DNA 1 μL(50 ng·μL-1)。擴增程序為：94 ℃預變性4 min； 94 ℃變性50 s，58～62 ℃退火50 s(依據引物的退火溫度)，72 ℃延伸50 s，共35個循環；最后 72 ℃延伸10 min。擴增產物經8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、硝酸銀染色后置于膠片觀察燈上照相。

1.5 遺傳距離估算和連鎖分析

用JoinMap 4.0軟件計算SSR分子標記與抗條銹病基因之間的遺傳距離，用MapDraw V2.1軟件繪制該基因的遺傳連鎖圖譜。

2 結果與分析

2.1 BJ399對條銹病的抗性鑒定結果和遺傳分析

表1 BJ399對條銹菌小種CYR34的抗性遺傳分析Table 1 Genetic analysis of resistance to CYR34 in wheat germplasm BJ399

2.2 抗條銹病基因 YrBJ399的分子標記定位 結果

隨機選取分布在整個小麥基因組上的400對SSR引物分別在抗病親本BJ399、感病親本銘賢169、抗病池和感病池DNA上進行PCR擴增，結果發現位于2AS染色體上的SSR標記Xgwm425在抗、感親本和抗、感池間存在多態性，用Xgwm425分別在10株純合抗病株和10株純合感病株上進行小群體上驗證，發現標記Xgwm425和抗病基因YrBJ399有連鎖關系。進一步選取2AS染色體上的其他SSR標記進行檢測，發現標記Xwmc296和Xgwm558均具有多態性，分別將這3個SSR標記(表2)在F2分離群體上進行檢測，發現均與YrBJ399存在連鎖關系，且3個標記都為共顯性標記，在F2代群體上的分離均符合1∶2∶1的孟德爾遺傳(表3)。標記Xwmc296和Xgwm425在BJ399/銘賢169分離群體部分單株上的擴增結果見圖1和圖2。

表2 與BJ399抗條銹病基因連鎖的分子標記引物序列Table 2 SSR primer sequences linked with stripe rust resistant gene derived from BJ399

表3 SSR標記在(BJ399×銘賢169)F2代群體的分離Table 3 Segregation ratios of SSR markers in(BJ399×Mingxian 169) F2

M:50 bp ladder; 1:BJ399; 2:銘賢169; 3:抗病池; 4:感病池; 5～9:純合抗病單株; 10～13:雜合單株; 14～18:純合感病單株。

M:50 bp ladder; 1:BJ399; 2:銘賢169; 3:抗病池; 4:感病池; 5～9:純合抗病單株; 10～14:雜合單株; 15～19:純合感病單株。

2.3 連鎖分析

利用JoinMap 4.0軟件對3個SSR標記位點與抗條銹病基因YrBJ399連鎖分析，結果表明3個標記都位于抗病基因YrBJ399的一側，抗病基因和分子標記在染色體上的排列順序為YrBJ399-Xwmc296-Xgwm425-Xgwm558，最近標記Xwmc296與抗條銹病基因YrBJ399的遺傳距離為9.5 cM，標記Xgwm425與抗條銹病基因YrBJ399的遺傳距離為14.3 cM，由于3個SSR標記均位于小麥2AS染色體上，因此，抗病基因YrBJ399被初步定位于2AS染色體上，靠近著絲點。據此繪制抗條銹基因YrBJ399的遺傳連鎖圖(圖3)。

圖3 抗條銹基因 YrBJ399 的遺傳連鎖圖譜

3 討 論

本研究對種質資源BJ399的遺傳分析表明，BJ399對目前中國條銹菌流行小種CYR34具有良好的抗病性，是一個優異的抗病種質資源，BJ399對CYR34的抗銹性由1對顯性基因控制，該基因暫命名為YrBJ399, 利用SSR分子標記篩選到3個與目標基因連鎖的標記Xwmc296、Xgwm425和Xgwm558，初步將抗病基因YrBJ399定位到染色體2AS上，并構建了分子標記連鎖 圖譜。

目前定位于小麥2AS染色體上的抗條銹基因有Yr17、YrElm1-4、YrZL16、YrZM175、YrCH5026、YrSph和YrR61等。Yr17[22-23]來源于偏凸山羊草，已被轉育到普通小麥品系VPM1中；YrElm1-4來源于柔軟濱麥草，楊敏娜等[24]將YrElm1-4定位到2AS，距其最近的SSR標記Xwmc522的遺傳距離為5.9 cM；馬東方等[25]將中梁16中的抗銹基因YrZL16定位到2AS，與SSR標記 Xbarc212和Xwmc177緊密連鎖，遺傳距離分別為5.4 cM和6.6 cM，并推測YrZL16來源于水源11；Lu等[26]推測YrZM175來源于BPM27，距其最近的SSR標記Xgwm636的遺傳距離為4.9 cM；侯麗媛等[27]在小麥與中間偃麥草滲入系CH5026中發現抗病基因YrCH5026，并判斷YrCH5026來源于中間偃麥草Z1141，與其緊密連鎖的標記為Xwmc382和Xgpw7101；YrSph[28]來源于印度圓粒小麥，為隱性基因；YrR61[29]來源于美國軟紅冬麥，為成株期抗病基因。而種質資源BJ399起源于歐洲，屬普通小麥品種(張學勇，私人通訊)。從抗病基因來源看，YrBJ399是不同于Yr17、YrElm1-4、YrZL16、YrZM175、YrCH5026、YrSph及YrR61的抗病基因。

從抗病基因所在染色體位置分析，YrElm1-4位于標記Xgwm636和Xwmc522區間，YrZL16位于標記 Xbarc212和Xwmc177區間，YrZM175位于標記Xwmc382和Xgwm636區間，標記 Xbarc212和Xwmc177、Xwmc382和Xgwm636都位于2AS中上部，標記Xgwm636和Xwmc522位于2AS中部[21]。YrCH5026和YrBJ399雖都位于2AS著絲粒附近，但YrCH5026位于標記Xwmc382和Xgpw7101區間，與標記Xwmc382的遺傳距離為6.0 cM，YrBJ399與最近標記Xwmc296的連鎖距離為9.5 cM，SSR標記Xwmc382與Xwmc296的相對遺傳距離為33.0 cM[21]，故YrCH5026與YrBJ399明顯不同。此外，用與YrElm1-4、YrZL16、YrZM175、YrCH5026連鎖的標記在本研究的抗感親本、抗感池上進行擴增，在抗感親本和抗感池間均無多態性。Yr17單基因系苗期接種CYR34，其抗病性表現為中抗(反應型2)，而BJ399對CYR34的抗病性表現為免疫或近免疫。綜合以上結果，推測BJ399所含的2AS上的抗條銹病基因YrBJ399與已知的Yr基因不同，可能為新的抗條銹病基因。

CYR34對Yr10和Yr26具有聯合毒性，該小種的發展對我國各主要麥區尤其甘肅隴南麥區的小麥生產構成嚴重威脅[5]。對國外引進的重要抗源材料進行抗病基因組成和抗病特點研究，是合理利用抗病品種的基礎[30]。在當前優勢小種CYR34的流行壓力下，BJ399對CYR34表現出良好的抗病性，因此是一個具有巨大應用潛力的抗源材料，在小麥抗條銹病育種中應合理利用。由于本研究中所獲得的標記與抗病基因的遺傳距離較遠，需繼續尋找與抗病基因連鎖更為緊密的標記，以便更好地應用于分子標記輔助育種中。