中國傳統酒類中生物胺的研究進展

周 軍，敖宗華，邵 燕，宋 艷，姚 瑤，許 馳

（1.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州 646000；2.國家固態釀造工程技術研究中心，四川瀘州 646000）

白酒和黃酒是中國的國酒，產銷量巨大，據中國酒業協會數據顯示，2018 年白酒、黃酒產業累計實現銷售收入5531.28 億元[1]。其典型生產工藝是以糯米、高粱、小麥、玉米和大米等單一或多種糧谷為原料，以大曲或小曲為糖化發酵劑，采取“雙邊發酵”的固態或半固態釀造方式生產。在上述開放式的釀造過程中，自然接種的酵母菌、細菌、真菌、霉菌等多種菌株順序或協同進行糖代謝、蛋白質代謝及脂質代謝[2-3]，在生成復雜風味物質的同時，也極易代謝產生或由環境遷入多種潛在危害化合物。其中，發酵過程中的氮代謝危害物正受到研究者的普遍關注。

生物胺（Biogenic Amines，BAs）是一類低分子含氮化合物，食品中的生物胺一般是脫羧酶對相應的氨基酸進行微生物脫羧生成的[4]。根據生物胺化學結構的差異，可將其分為3 類：（1）脂肪族生物胺，如腐胺、尸胺和精胺等；（2）芳香族生物胺，如酪胺、苯乙胺和苯丙胺等；（3）雜環族生物胺，如組胺、色胺和吡咯烷等[5]；根據其中胺含量的差異，可將其分為2 類：（1）單胺，如組胺、酪胺和苯乙胺等；（2）多胺，如尸胺、精胺和亞精胺等[6]。低濃度的生物胺對人體有益，是荷爾蒙、生物堿和蛋白質等生物活性物質的合成前體[7]；高濃度的生物胺則對人體有害，如：敏感體質人群對生物胺會發生過敏反應；酪胺的大量攝入會導致頭痛、血壓變化，并可能導致腦出血、心臟衰竭等不良反應；組胺的大量攝入會導致皮疹、水腫等皮膚疾病，亦可導致嘔吐、腹痛等腸胃不適和頭痛、呼吸困難和低血壓反應等不良反應[8]。

腐胺、尸胺、精胺、亞精胺、酪胺、苯乙胺、組胺和色胺等8 種生物胺在調味品、發酵香腸、葡萄酒、奶酪、肉制品和水產品等食品中被廣泛檢出[7]。一些國家和地區已對不同食品中生物胺（以對組胺的限量為主）的含量規定了限量標準。我國規定鮐魚等高組胺水產品及其他海水魚類中組胺的最高限量分別為400 mg/kg 和200 mg/kg；歐盟規定鮮魚及發酵魚中組胺的最高限量分別為200 mg/kg和400 mg/kg，其他食品中組胺最大限量為100～200 mg/kg；美國規定水產品中組胺及酪胺最高限量分別為50 mg/kg 和100 mg/kg，其他食品中組胺的最高限量為50 mg/kg[9]；新西蘭和澳大利亞規定水產品中組胺最大限量為200 mg/kg[10]。含乙醇的酒精性飲料，由于乙醇對胺氧化酶活性的抑制作用，可顯著增強酒類制品中生物胺的生理毒性，因此，理論上生物胺的限量標準應設置得更低。目前，已有多個國家對葡萄酒中的組胺最高限量設定了標準，如，瑞士和澳大利亞的最高限量標準為10 mg/L，法國的最高限量標準為8 mg/L，荷蘭的最高限量標準為3.5 mg/L，德國的最高限量標準為2 mg/L[7]。

市售黃酒、白酒的酒精度一般在14 %vol～20%vol 和35%vol～60%vol 之間，均高于葡萄酒，但我國至今尚未建立上述傳統酒中生物胺含量的限量標準。因此，本文綜述了白酒和黃酒中生物胺的前處理方法、檢測手段、控制措施，并展望了研究中存在的問題及未來的潛在研究熱點，以期為相關標準的建立和政府監管部門的決策提供基礎數據和科學依據。

1 生物胺檢測

1.1 樣品前處理方法

生物胺的結構多樣，且在白酒、黃酒等復雜基質中的濃度較低。因此，高效準確前處理方法的建立，不僅可除去可能干擾色譜分析的其他化合物進而提高目標分析物的響應信號，更是高通量檢測的基礎。

針對白酒、黃酒中生物胺的前處理方法早期以直接進樣為主，目前以液液萃取（LLE）為主，其萃取原理是基于各類化合物在不同極性溶劑中的溶解度差異而分離，常用的萃取溶劑為甲苯、氯仿、二氯甲烷等極性較強的有機溶劑[11]。2006 年，陸永梅等[12]首次對黃酒中生物胺進行定量檢測，采用直接取樣，衍生化后經高效液相色譜定量；2013年，范文來等[13]參考Ough 等的方法并進行優化，首次對白酒中生物胺的分布進行了定性檢測，前處理方法為液液萃取，萃取劑為二氯甲烷和丁醇，檢測儀器是氣相色譜-質譜聯用儀。

但傳統液液萃取（LLE）方法具有操作復雜、有機溶劑消耗量大、后富集時間長的缺點，一些基于LLE 的微萃取方法如：液相微萃取（LPME）[14]、基于懸浮溶劑固化的分散液液微萃取（DLLMESFO）[15]、渦旋輔助-表面活性劑-液液微萃取（VSLLME）[16]和鹽析輔助液液萃取（SALLE）[17]等正越來越廣泛應用到食品中生物胺的快速萃取。2009 年，Saaid 等[14]建立了以液相微萃取為前處理方法，結合高效液相色譜-紫外法對蝦醬和番茄醬中5 種生物胺的高效檢測；2013 年，Jia 等[15]建立了以懸浮溶劑固化的分散液液微萃取技術（DLLMESFO）為前處理方法，結合液相色譜-紫外法對白葡萄酒、紅葡萄酒、米酒、啤酒中9 種生物胺含量的快速測定方法；2014 年，Donthuan 等[16]應用渦旋輔助-表面活性劑-液液微萃取（VSLLME）為前處理方法，結合高效液相色譜法對發酵魚類、葡萄酒、啤酒中的生物胺進行了準確測定；2015 年，Jain 等[18]在傳統LLE 基礎上，以硫酸銨進行鹽析，建立了以鹽析輔助液液萃取技術為前處理方法，結合高效液相色譜法對果汁、酒精飲料中的生物胺含量快速測定的方法，該方法在減少了萃取劑用量的同時，降低了副產物的含量。

近年來，基于固相萃取技術（SPE）的前處理方法也開始應用到食品中生物胺的檢測，與上述基于LLE 方法萃取原理不同，SPE 原理是根據樣品中不同組分對溶劑和吸附劑的親和力差異而分離[19]。Zhang 等[20]建立了以Oasis MCX 固相萃取小柱為吸附材料，洗脫、富集、衍生化、經高效液相色譜法檢測對黃酒中7 種生物胺的準確定量方法。但SPE萃取、脫附和富集過程中，需要復雜的梯度洗脫及樣品濃縮過程，為此，基于SPE 的改性新技術，如固相微萃取技術（SPME）、分子印跡固相萃取（MISPE）、氣體擴散微萃取（GDME）和基質輔助固相分散萃取（MSPD）等前處理手段被用于果汁、葡萄酒、金槍魚等食品中生物胺的檢測[21-23]。Self 等[23]建立了以MSPD 為樣品前處理手段，結合高效液相色譜法對金槍魚中生物胺進行快速、準確測定的方法，MSPD 由于其簡便、高效的萃取能力，在食品、藥品的生物胺快速檢測中展現出良好的發展潛力。

上述新的前處理方法普遍具有綠色、高效、準確的優點，在白酒、黃酒生物胺的日常檢測和企業質控中表現出巨大的潛在應用價值。

1.2 生物胺的檢測方法

目前，針對食品中的生物胺的檢測方法主要有：高效液相色譜法、氣相色譜法，薄層色譜法、離子色譜法、毛細管電泳法和酶聯免疫吸附法等。

1.2.1 高效液相色譜法

生物胺的沸點相對較高、高溫不太穩定，因此，高效液相色譜法是食品中生物胺檢測的最常用方法。研究早期多采用紫外或熒光與高效液相色譜聯用，但生物胺化學結構缺乏特征發色官能團，因此，必須進行衍生化處理，圖1 所示是衍生化反應的典型反應方程式，其機理是活潑氫的親核取代反應[24]，衍生化試劑主要是：鄰苯二甲醛（OPA）、丹磺酰氯（DNS-Cl）、苯甲酰氯（BzCl）。

在上述衍生化反應中，DNS-Cl 和BzCl 與生物胺的衍生物相對比較穩定，但此兩種衍生化試劑均為非特異性試劑，可與食品中其他基質如酚類、脂肪醇的活潑氫反應，因此，對樣品的前處理要求較高；OPA 只能與初級生物胺發生衍生化反應，且衍生物穩定性相對較差，因此，常與2-巰基乙醇一起使用[25]。由于紫外或熒光檢測器均需要上述復雜的衍生化過程，因此，高效液相色譜與質譜聯用技術在食品中生物胺的檢測越來越受到研究者的關注，該技術在避免衍生化的同時，還可以提供豐富的物質結構信息。Sirocchi 等[26]建立了HPLC-MS/MS 方法對肉中10 種未經衍生化生物胺的直接測定方法。隨著質譜技術的進步，飛行時間質譜法、四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜法等也被用于復雜基質中生物胺的檢測[27-28]。

1.2.2 氣相色譜法

氣相色譜法不能檢測揮發性較弱或熱不穩定化合物，在對食品中生物胺檢測時需要衍生化以降低化合物極性，提高揮發性，以改善化合物在色譜柱中的駐留，因此，氣相色譜法在生物胺的檢測中有一定天然劣勢。Awan 等[29]建立了固相微萃取纖維頭衍生化結合氣質聯用儀對肉類、蔬菜及奶酪中的腐胺及尸胺檢測的方法，該方法直接在蒸汽狀態下于萃取頭上衍化，大幅簡化了操作流程，提高了檢測效率。

1.2.3 薄層色譜法

薄層色譜法不依托昂貴的儀器，具有批處理樣品量大、檢測快速和易于操作的優勢，對圖像采集和分析系統的改進，薄層色譜法克服了以往僅能定性不能定量的弱點。Romano 等[30]建立了薄層色譜法對葡萄酒中的生物胺檢測的方法，其借助不同濃度標準品和待測樣品在254 nm 紫外燈照射下的熒光強度，經圖像處理軟件轉化為數字化濃度，實現了對葡萄酒中生物胺的快速定量。

1.2.4 離子色譜法

離子色譜法是基于離子交換能力或組分選擇性系數的差異達到分離的目的，生物胺具有陽離子性質，無需衍生化適合離子色譜分離。Palermo等[34]依托多線性梯度洗脫、甲基磺酸和弱離子交換柱的使用，建立了離子色譜法對鳳尾魚、奶酪、葡萄酒和意大利臘腸中8種生物胺的檢測方法。

1.2.5 毛細管電泳法

毛細管電泳原理是基于樣品中不同組分在高壓電場和毛細管作用下的遷移率和分布特征不同以達到分離的目的。Cortacero 等[35]建立了離子色譜結合激光誘導/熒光檢測器對啤酒及其發酵過程中10種生物胺的準確檢測方法。

1.2.6 酶聯免疫吸附法

酶聯免疫吸附法的原理是基于抗原抗體之間的免疫反應，由于抗原或抗體標記的酶可以催化并放大底物反應，因此該方法的靈敏度較高，但價格較昂貴。具體實驗過程是用生物胺免疫實驗動物以制備特異性單克隆抗體，用該抗體檢測食品中生物胺含量。Marcobal 等[31]建立了酶聯免疫吸附法對61 種產自西班牙不同地區葡萄酒中生物胺的含量測定方法，組胺、酪胺和苯乙胺的含量均低于研究者預期，且生物胺含量與葡萄酒陳釀時間不相關。

1.3 白酒中生物胺檢測進展

目前，針對白酒中生物胺的研究尚不夠系統，尚未見對白酒中生物胺整體含量的權威性報道。與白酒相關的生物胺報道最早可追溯至2012年。

2012 年，杜木英等[32]建立了氨基酸自動分析儀結合液相色譜對青稞酒釀造過程中7 種生物胺含量的追蹤方法。結果表明，發酵過程中生物胺總量變化不顯著，隨發酵的進行新生成了組胺；組胺和酪胺隨發酵時間延長含量上升，腐胺及胍丁胺隨發酵過程含量下降，尸胺、精胺、亞精胺含量變化不明顯。

2013 年，溫永柱[13]等建立了LLE 結合氣相色譜-串聯質譜聯用方法，首次在中國白酒中定性鑒定出：尸胺、腐胺、甲胺、乙胺、環戊胺、異戊胺、環己胺、環庚胺、吡咯烷等9種生物胺。

2013 年，溫永柱等[33]借助LLE 結合高效液相色譜-紫外檢測器，對白酒中5 種生物胺的含量進行了檢測。

2015 年，范文來等[34]建立了液液微萃取(LLME)結合高效液相色譜法檢測酒醅發酵及蒸餾過程中5 種生物胺的含量變化規律。結果表明，除尸胺是隨著發酵時間一直上升外，其他4 種生物胺均呈現先上升，再緩慢下降的規律；與其他飲料酒相比，白酒中的生物胺含量最低。

2017 年，王春利等[35]建立了液液微萃取(LLME)結合高效液相色譜法對白酒中8 種生物胺的快速檢測方法，衍生化試劑選擇的是丹磺酰氯，對隨機抽取的5 種市售醬香型白酒的檢測結果顯示，色胺是主要生物胺，酪胺含量較低，其余6 種生物胺均未檢出。

綜上所述，對于白酒中生物胺的富集方法主要是液液萃取和液液微萃取。液液萃取由于溶劑消耗量大、操作復雜、耗時長等缺點，被液液微萃取逐步取代；高效液相色譜儀仍是目前檢測白酒中生物胺的主要儀器，但其復雜、耗時的衍生化過程成為制約快速檢測的決定性因素。

1.4 黃酒中生物胺檢測進展

針對黃酒中生物胺檢測的研究要早于白酒的研究，目前建立的主要檢測方法為：高效液相色譜法、離子對液相色譜法、薄層色譜法等。

2006 年，陸永梅等[12]首次采用丹磺酰氯為衍生化試劑，建立了高效液相色譜法對黃酒中的5 種生物胺（組胺、酪胺、尸胺、亞精胺、精胺）的檢測方法。

2012 年，玉瀾等[36]應用室溫離子液體為前處理手段，經丹磺酰氯衍生，結合高效液相色譜儀建立了對黃酒中6 種生物胺（酪胺、尸胺、精胺、腐胺、苯乙胺、色胺）的準確檢測方法。

2014 年，彭祺等[37]建立了高效液相色譜串聯三重四級桿質譜法對黃酒中主要的8 種生物胺的檢測方法，該方法無需進行衍生化處理，顯著縮短了樣品前處理時間，適合黃酒的批量檢測。

2014 年，華永有等[38]建立了高效液相色譜-熒光檢測法(HPLC-FLD)同時檢測黃酒中的9種生物胺的方法。根據峰面積比較，熒光比紫外檢測的靈敏度高一個數量級，本法操作簡便、準確可靠。

2016 年，曹利瑞等[39]建立了一種三氯乙酸提取，丹磺酰氯柱前衍生化，高效液相色譜-紫外檢測器對黃酒中9 種生物胺含量測定的方法。結果顯示，在5 種黃酒樣品中，總生物胺含量的范圍在6.741～161.48 mg/L 之間；均未檢測出鹽酸吡哆胺；8種生物胺的含量差別明顯。

2017 年，杜賽等[40]建立了柱后衍生-離子對液相色譜法對發酵酒中8 種主要生物胺的檢測方法，該方法數據準確、方法簡便，適合日常批量分析檢測。

2017 年，李燕君等[41]建立了一種改進的薄層色譜法檢測不同發酵階段及不同年份黃酒中生物胺含量的方法，結果顯示，該方法適合6 種生物胺（組胺、酪胺、尸胺、亞精胺、精胺、腐胺）的定性、定量分析，且該方法操作簡便、費用低，可同時檢測多個樣品。

2018 年，冷宜昕等[42]建立了激光解吸/激光后電離質譜法快速檢測黃酒中的酪胺，該方法無需樣品前處理，可直接用于黃酒樣品的快速分析，且譜圖簡單清晰，信噪比高，適用于黃酒中酪胺含量的快速檢測。

黃酒中生物胺檢測方法主要是液相色譜法，通常需要衍生化之后，結合紫外或者熒光檢測器檢測。黃酒由于釀造原料中氨基酸含量豐富，且其屬于非蒸餾酒，因此，黃酒中生物胺含量相對較高。張敬等[43]對3 種不同發酵酒中生物胺含量進行測定，結果顯示，黃酒、葡萄酒、啤酒的平均含量分別為78.304 mg/L、11.240 mg/L 和4.787 mg/L，黃酒中生物胺含量最高。溫永柱等[33]的研究結果揭示，無論在清香型、濃香型或醬香型成品白酒中，生物胺平均含量均低于2 mg/L。

2 控制措施

目前，針對白酒、黃酒中生物胺的定向消減或調控機制的研究尚不夠系統，借鑒其他食品中生物胺的來源分析及控制措施，普遍認為可從如下三方面進行調控：從源頭處調控、加工貯存中調控、產生后消減其含量。

2.1 從源頭處調控

生物胺的微生物代謝底物多為原料中含氮物質，其中，蛋白質和氨基酸是其主要代謝底物，因此，在不影響產品質量基礎上，建議使用蛋白質/氨基酸含量略低的原料，以減少最終產物中生物胺的積累[44-45]。此外，發酵過程中的選用菌株以無或少氨基酸脫羧酶活性的菌株代替原有菌株，進而減少微生物代謝的積累，但白酒、黃酒自然接種的發酵方式和開放式生產，很難對菌種進行定向選育。

2.2 生產過程中調控

對實際生產過程人為調控，會顯著減少最終產品中生物胺的含量。如：黃酒生產過程生物酸化浸米技術的應用；白酒生產中縮短與窖泥接觸時間；發酵完成，及時終止代謝反應[46]。此外，還可以將一些在葡萄酒和奶酪發酵過程中發現的具有降解生物胺的菌株，應用到白酒和黃酒生產中。Joosten等[47]證實將產細菌素和產乳酸鏈球菌素的菌株添加到奶酪生產過程中，有效的抑制了產生物胺菌株的生長，顯著降低了產品中生物胺含量。Garcia-Ruiz 等[48]發現，從葡萄酒釀造微生物中篩選出的乳酸菌、片球菌屬的9 株菌株對生物胺表現出較強的降解能力，其中編號為L.caseiIFI-CA 52 的菌株生物胺降解能力最強。因此，篩選或培育出適合白酒、黃酒中生物胺降解的有效菌株是未來研究的重要方向。

2.3 產生后消減

白酒、黃酒基酒生產后均需要較長的陳釀過程，此過程中生物胺的含量也存在動態變化。何晨怡等[49]發現在25 ℃和37 ℃條件下，隨貯藏時間的延長，黃酒中尸胺的含量呈下降趨勢，組胺含量變化不顯著，酪胺含量呈上升趨勢。欒同青等[50]發現將同一批次黃酒分別貯存在4 ℃、20 ℃和37 ℃條件下，其組胺、酪胺和腐胺的含量與時間呈負相關，即低溫、短貯藏時間有利于生物胺含量的消減。但上述研究尚不夠系統，上述結論均需進一步的文獻支持。

3 總結與展望

白酒、黃酒作為最具中國本土化特色的傳統發酵酒，近年來一直在追尋“風味、健康雙導向”的發展理念，安全性是健康的基礎。本文綜述了兩種傳統酒中生物胺的前處理方法、檢測手段、控制措施，特別是針對檢測的歷史沿革、新的技術手段和潛在的消減策略做了系統論述，對我國傳統蒸餾酒的技術升級、政府監管部門的標準制定和未來相關領域的發展方向提供了基礎的數據支撐。