超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定葡萄酒中赭曲霉毒素A的方法的優(yōu)化研究

趙天宇 ，楊 帛，劉銳萍，張 然，趙廣西，杜 偉，李 軍

（1.河北科技師范學(xué)院，河北秦皇島 066000；2.秦皇島市食品藥品檢驗(yàn)中心，河北秦皇島 066000）

赭曲霉毒素（ochratoxin）是多種霉菌產(chǎn)生的次級代謝物，是一種真菌毒素。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有7 種曲霉和6 種青霉菌能產(chǎn)生赭曲霉毒素，但大部分由純綠青霉、赭曲霉和碳黑曲霉產(chǎn)生[1]。赭曲霉毒素分為赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)、赭曲霉毒素B(ochratoxin B，OTB)和赭曲霉毒素C(ochratoxin C，OTC)等。毒性最大、分布最廣、對人體傷害最大的是OTA，主要毒性有腎臟毒、肝毒、致畸、致癌等[2]。由于葡萄的生長環(huán)境和葡萄酒的釀制工藝等原因，經(jīng)常會(huì)造成赭曲霉毒素的污染[3-4]。劉青等[5]對9 個(gè)國家中的11 種不同種類的葡萄酒進(jìn)行篩查，OTA的檢出率高達(dá)45.4%，檢出濃度為1.1～11.5 μg/L，有4 個(gè)樣本超過2 μg/L。我國GB 2761—2017 標(biāo)準(zhǔn)[6]和歐盟法規(guī)[7]規(guī)定OTA 在葡萄酒中的最大殘留量為2 μg/kg。隨著檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，檢測方法的精確度不斷提高，同時(shí)為提高效率，也需要更加簡單、高效的前處理方法。

目前應(yīng)用于葡萄酒中OTA 的檢測方法主要有高效液相色譜（HPLC）法[8-9]與高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法[10-13]。前者的檢測靈敏度高，設(shè)備普及，適合推廣。后者的準(zhǔn)確度高、靈敏度高、具有很高的可重現(xiàn)性，但其價(jià)格昂貴，檢測成本高。在我國GB 5009.96—2016[14]標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中赭曲霉毒素A 的檢測方法，樣品前處理主要采用固相萃取和免疫親和柱法，前處理耗時(shí)太長，成本過高，并不適用于大批量葡萄酒樣品的檢測。QuEChERS 是一種集快速、簡單、便宜、有效、可靠、安全于一體的前處理技術(shù)，目前廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥、獸藥殘留的分析檢測[15-17]中。近年來，也逐漸應(yīng)用于真菌毒素的檢測[18-21]當(dāng)中。

本研究建立了一種利用UHPLC-MS/MS 法測定葡萄酒中的OTA 的方法，并基于QuEChERS 前處理方法對前處理進(jìn)行優(yōu)化。開發(fā)出無需凈化的前處理方法，極大縮短了前處理時(shí)間，節(jié)約了成本，能滿足大批量樣品的快速檢測需要。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：葡萄酒為昌黎產(chǎn)紅葡萄酒。

試劑：OTA 標(biāo)準(zhǔn)品（CAS:303-47-9，10 μg/mL，pribolab），乙腈、甲醇和甲酸均為色譜純，甲酸銨、乙酸鈉和無水硫酸鎂均為分析純。

儀器設(shè)備：超高效液相色譜（CBM-20A，日本島津）-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（TRIPLE QUADTM 5500，美國AB）、ME204T 電子天平（上海梅特勒-托利多有限公司）、NP-30S 漩渦混合器（常州恩培儀器制造有限公司）、摩爾元素型Molecular1815d 超純水機(jī)（重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司）、Velocity14 離心機(jī)（英國Dynamica）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國heidolph）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：以乙腈+甲醇（50+50）為溶劑配制1 μg/mL 的OTA 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20 ℃冷凍保存，有效期為3個(gè)月。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋至100 ng/mL，并逐步稀釋成標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度1.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、50.0 ng/mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 樣品前處理

準(zhǔn)確移取2.5 mL 葡萄酒樣品于50 mL 具塞離心管中，加入20 mL 乙腈、0.5 g 醋酸鈉和2 g 無水硫酸鎂。漩渦振蕩3 min使其混勻，8000 r/min下離心10 min，取出上清液。殘?jiān)貜?fù)以上步驟，將兩次所得上清液合并，在40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，剩余物質(zhì)用乙腈-水（30+60）溶液2 mL 復(fù)溶，溶液過有機(jī)微孔濾膜（0.22 μm）后，留待儀器分析測定。

1.2.3 基質(zhì)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)

將不含目標(biāo)待測物的樣品經(jīng)上述前處理后作為基質(zhì)空白，向基質(zhì)空白中加入不同濃度的OTA標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與純?nèi)軇┡渲茦?biāo)準(zhǔn)曲線的斜率之比，來判定葡萄酒基質(zhì)對OTA的增強(qiáng)或抑制作用。

1.2.4 線性范圍、檢出限（LOD）及定量限（LOQ）

向不含OTA 的基質(zhì)空白溶液添加不同濃度的OTA 標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)有機(jī)微孔濾膜（0.22 μm）過濾后，MRM 模式檢測，分析添加濃度與響應(yīng)值的相關(guān)性，得到基質(zhì)曲線。檢出限和定量限分別為基質(zhì)曲線的最低點(diǎn)濃度的3倍和10倍信噪比（S/N）。

1.2.5 回收率和精密度實(shí)驗(yàn)

向不含OTA 的葡萄酒基質(zhì)中添加不同濃度的OTA 標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加量分別為1 ng/mL、4 ng/mL 和10 ng/mL。經(jīng)上述步驟處理、檢測后，使用基質(zhì)曲線定量，計(jì)算回收率和精密度。

1.2.6 儀器條件

色譜條件：色譜柱：Atlantis?T3（2.1×150 mm，3 μm）；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL；流速0.2 mL/min；流動(dòng)相A 為1‰甲酸（含0.5 mmol 甲酸銨），B 為乙腈；洗脫條件見表1。

表1 色譜梯度洗脫條件

質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：負(fù)離子掃描。檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測MRM；電噴霧電壓（IS）：-4500V；霧化器壓力（GSI）：30 Psi；氣簾氣壓力（CUR）：25 Psi；輔助氣壓力（GS2）：30 Psi；離子源溫度：500 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

配制濃度為50 ng/mL 的OTA 標(biāo)準(zhǔn)溶液，對其進(jìn)行質(zhì)譜掃描，優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)。通過調(diào)節(jié)去簇電壓、碰撞氣能量等參數(shù)觀察目標(biāo)化合物母離子和子離子碎片的響應(yīng)情況。結(jié)果見圖1、圖2。根據(jù)響應(yīng)最優(yōu)原則確定各項(xiàng)參數(shù)的數(shù)值，結(jié)果見表2。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇

表2 質(zhì)譜分析參數(shù)

為提高化合物在離子源中的電離效率，通常會(huì)向流動(dòng)相中添加揮發(fā)性酸和緩沖鹽體系。少量的有機(jī)酸還能改善峰型。本實(shí)驗(yàn)分別采用乙腈-水體系、乙腈-水（1‰甲酸）體系、乙腈-水（0.5 mmol 甲酸銨）體系、乙腈-水（1 ‰甲酸、0.5 mmol 甲酸銨）體系進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)甲酸的加入可以有效改善峰型，甲酸銨的加入可以使基線分離，消除拖尾。考慮到儀器維護(hù)及清理的問題，甲酸和甲酸銨均添加在超純水中。因此選用乙腈-1 ‰甲酸（0.5 mmol甲酸銨）體系。

2.1.3 洗脫梯度的優(yōu)化

經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，梯度洗脫時(shí)有機(jī)相濃度低時(shí)會(huì)導(dǎo)致OTA 洗脫不徹底，會(huì)對基線和下一針樣品結(jié)果出現(xiàn)影響。當(dāng)梯度洗脫有機(jī)濃度達(dá)到95 %時(shí)，能縮短洗脫時(shí)間，洗脫效果最好，見圖3。

2.2 前處理方法的優(yōu)化

葡萄酒為液體，樣品與溶劑的體積比會(huì)對萃取效率產(chǎn)生顯著的影響。在樣品中添加10 ng/mL 的OTA 標(biāo)準(zhǔn)溶液，并以2 倍、3 倍、5 倍、8 倍、10 倍樣品體積的乙腈作為提取液進(jìn)行前處理，經(jīng)UHPLCMS/MS 測定后，將所得峰面積與相同濃度的OTA標(biāo)準(zhǔn)品峰面積進(jìn)行比較，回收率結(jié)果見表3。回收率隨體積比的增加而增加，當(dāng)達(dá)到8 倍體積比時(shí)達(dá)到89 %，繼續(xù)增加乙腈用量，回收率不會(huì)繼續(xù)上升。本實(shí)驗(yàn)選取C18固相萃取填充料對樣品進(jìn)行凈化處理后發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的回收率并沒有比直接用乙腈提取上樣高。綜合效率及成本等考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇直接用乙腈提取上樣。

表3 不同體積比下OTA回收率

2.3 基質(zhì)效應(yīng)評價(jià)

基質(zhì)曲線與純?nèi)軇┡渲茦?biāo)準(zhǔn)曲線相比，斜率比值為0.289，基質(zhì)效應(yīng)明顯。因此，定量分析時(shí)選用基質(zhì)曲線既可以提高定量分析準(zhǔn)確性又可以保證定性離子的準(zhǔn)確性。

2.4 方法的線性范圍、檢出限（LOD）及定量限（LOQ）

赭曲霉毒素A 在1.0～50.0 ng/mL 范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，線性方程為y=3079.85058x+16392.92319，相關(guān)系數(shù)（r）為0.99971。檢出限LOD為0.029 μg/mL，定量限LOQ 為0.098 μg/mL。遠(yuǎn)低于規(guī)定的最高限量（2 μg/kg）。

2.5 方法的回收率及精密度

以國標(biāo)中OTA 的最大殘留限量（MRL）為依據(jù)，選擇分別添加1.0 ng/mL、4 ng/mL 和10 ng/mL濃度作為方法的回收率實(shí)驗(yàn)。每個(gè)加標(biāo)實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次平行，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差評價(jià)精密度，見表4。

表4 OTA的回收率與精密度

2.6 樣品測定

選取20 個(gè)昌黎本地紅葡萄酒為酒樣，使用本方法對OTA進(jìn)行測定，并無OTA檢出。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了一種基于QuChERS 的前處理方法，從提取方法、溶劑和流動(dòng)選擇、流動(dòng)相等方面對方法進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)合UHPLC 串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜MRM 模式檢測的檢測方法，對基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了驗(yàn)證，并對儀器條件進(jìn)行了優(yōu)化，在保證回收率的前提下大大縮短了前處理的時(shí)間和節(jié)約了成本，出峰時(shí)間穩(wěn)定在3 min 左右。本方法前處理簡單、快速、靈敏度高、成本低，具有良好的可重現(xiàn)性，方法回收率均能達(dá)到94 %以上，檢出限0.029 μg/mL。該方法可以滿足GB 2761—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》標(biāo)準(zhǔn)中赭曲霉毒素A 的檢測要求，為葡萄酒安全檢測工作提供了一種簡便、快捷、準(zhǔn)確的檢測方法。