沼液回流提升推流式厭氧反應器運行效果研究

董麗麗， 曹廣麗， 武繼文， 任南琪

(哈爾濱工業(yè)大學 環(huán)境學院 城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室， 哈爾濱 150090)

近年來，隨著我國經(jīng)濟的迅速發(fā)展和人民生活水平的提高，我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展。同時畜禽養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)模不斷擴大，集約化程度逐年增高，隨之而來產(chǎn)生了越來越多的有機固體廢棄物和高濃度有機廢水，給環(huán)境帶來了嚴重污染和壓力。據(jù)統(tǒng)計，2015年，我國全年禽畜排放糞便量(包括尿液量)達到65.54億t，其中牛糞 20.94億t[1]。預計到2020年我國畜禽糞污每年總排放量會超過40 億t[2-3]。畜禽糞污雖然是農(nóng)業(yè)環(huán)境的主要污染源，但也是蘊含巨大能量的可再生能源，若能進行合理開發(fā)利用，可以創(chuàng)造巨大的經(jīng)濟效益和環(huán)境效益[4]。厭氧消化是畜禽糞污無害化和資源化處理應用的最有效方式之一[5-6]。

沼氣工程生產(chǎn)大量甲烷的同時還產(chǎn)生了大量的沼液。沼液作為沼氣工程中的一種有價值的副產(chǎn)物，其含有多種生物活性物質(zhì)，如氨基酸、維生素、微量元素等，可防治害蟲，提高抗病能力[7-8]。此外，沼液作為一種優(yōu)質(zhì)的基礎(chǔ)肥料，可以肥沃土壤，改良作物品種，提高產(chǎn)量。但由于很多大型沼氣工程周邊土地配套不足、同時農(nóng)田分散、季節(jié)性耕種等原因，沼液還無法充分實現(xiàn)全量利用[9]。這就造成了造成了嚴重的資源浪費和對環(huán)境的二次污染，不利于沼氣工程的建設(shè)和推廣。近年來，開始有人研究將厭氧消化的沼液再回流到厭氧系統(tǒng)中，這樣不僅能夠提升進料中的微生物含量，使底物得到更充分利用，又可減少沼液后續(xù)處理的負擔，從而保證了大中型沼氣工程的順利運行和可持續(xù)發(fā)展[10-11]。同時沼液回流技術(shù)為大中型沼氣工程運行過程中的減排和節(jié)約淡水資源提供重要的理論和現(xiàn)實意義。吳樹彪[12]在研究沼液回流對牛糞厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣特性能影響時得出的50%的沼液進行回流時，能夠提高基質(zhì)產(chǎn)甲烷率，促進厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中微生物的合成代謝。Guo[13]等研究結(jié)果指出餐廚垃圾和豬糞在中溫條件下進行發(fā)酵產(chǎn)甲烷，回流能夠增加基質(zhì)的產(chǎn)甲烷率。王星[14]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在低負荷條件下，提高消化液回流比可以使餐廚垃厭氧發(fā)酵系統(tǒng)的產(chǎn)氣量明顯提高。完全混合式反應器(Completely-stirred tank reactor, CSTR)和推流式反應器(Plug-flow reactor, PFR)是厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣工藝中最常見的兩種反應器[6]。相較于CSTR容易出現(xiàn)底物短流的現(xiàn)象，理想的PFR反應器不將底物與所有污泥完全混合，而是與部分污泥混合后從反應器的進料端進入反應器，使其在反應器長度方向呈活塞方式依次向前推進，直至反應器的出料端出料，從而能夠避免短流現(xiàn)象，尤其是在處理高含固率有機物(如畜禽糞便、農(nóng)作物秸稈)的發(fā)酵處理時，減小了動力消耗，降低了運行成本[15-16]。然而，對于沼液回流技術(shù)應用在PFR厭氧發(fā)酵牛糞產(chǎn)沼氣方面缺乏相應研究。

本文以牛糞為原料，在45 L半連續(xù)進料PFR的厭氧反應器中，設(shè)置未回流沼液和使用了回流進料量50%的沼液的進料方式，考察長期消化過程中沼液回流對產(chǎn)甲烷效率和穩(wěn)定性參數(shù)的影響。在100 d的連續(xù)運行中監(jiān)測每日的產(chǎn)氣量、氣體成分組成、進出料pH值、進出料的總干物質(zhì)含量(TS)和揮發(fā)性有機物含量(VS)、以及每隔3至7 d對反應器進行取樣監(jiān)測pH值的變化。同時結(jié)合高通量測序給出沼液回流后反應器處于穩(wěn)定運行期內(nèi)的微生物群落狀態(tài)。這為以牛糞為原料在PFR內(nèi)提升厭氧發(fā)酵效率提供了基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)，同時對大型沼氣工程運行降低成本、減少沼液后續(xù)處理及利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 牛糞及接種物

實驗中所用的牛糞取自哈爾濱完達山奶牛養(yǎng)殖有限公司(5000頭規(guī)模奶牛場)的泌乳牛舍。新鮮的牛糞收集到密閉的容器中，放置在4 ℃的冰箱中儲存。為了防止牛糞長時間存放導致營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，實驗所用牛糞每7天重新取一次。反應器啟動過程中所用接種沼液取自現(xiàn)代牧業(yè)雙城糞污處理項目，該項目采用的是PFR厭氧發(fā)酵工藝，裝機容量為3MW[6]。該項目自建設(shè)投產(chǎn)使用至今已經(jīng)連續(xù)穩(wěn)定運行5年，日產(chǎn)沼氣3.97萬立方米。牛糞和接種沼液的主要理化指標如表1所示。

表1 牛糞及接種沼液的特性( 質(zhì)量分數(shù))

1.2 實驗裝置和運行

實驗采用1個體積為45 L的PFR反應器(見圖 1)進行半連續(xù)進料厭氧發(fā)酵，有效發(fā)酵體積為36 L，水力停留時間(HRT)為20 d。在沼液回流運行期，每天回流進料量50%的沼液到進料底物。

圖1 推流式(PFR)厭氧發(fā)酵實驗裝置流程圖

實驗具體過程如下:在38 ℃±1 ℃發(fā)酵溫度下，反應器中接種36 L沼液開始啟動，啟動期間為了保證反應器內(nèi)微生物盡快適應新環(huán)境，采用逐漸增加進料量的進料方式，每天定時用蒸餾水將牛糞稀釋到TS濃度為7%～10%，配好的料液加熱至38 ℃±1 ℃后混勻進入反應器。當沼氣日產(chǎn)量、甲烷體積分數(shù)穩(wěn)定后逐步提升進料量直至設(shè)計負荷(反應器啟動的第1 天到18 天)，反應器開始進入運行階段(第19天到46 天)，反應器從第47 天開始回流沼液，具體步驟為:利用反應器每日出料的沼液與進料底物以 1∶2體積比混合均勻進入反應器，實驗繼續(xù)運行至第100 天結(jié)束。

1.3 檢測方法

為了檢測反應器啟動及運行過程的各項參數(shù)，進出料的樣品每天收集，取樣孔1，取樣孔2每隔5～7 d取樣一次。使用排水法記錄日產(chǎn)氣量。利用氣相色譜儀測定氣體組分和揮發(fā)酸(VFAs)(GC, 7890A, Agilent Cooperation, USA)；總固體含量(TS)與揮發(fā)性固體含量(VS)采用重量法測定；pH和化學需氧量(COD )用HACH-HQ40d multi和HACH-DRB 200測定?？偟?TN)和總磷(TP)用analytikjena multi N/C 2100s和Perkin Elmer Optima 8300測定。氧化還原電位用上海精密儀器公司生產(chǎn)的C220-ORP測定儀測定。

1.4 微生物Illumina MiSeq高通量測序

為了觀察回流沼液后反應器內(nèi)微生物群落的狀態(tài)，在反應器回流沼液運行穩(wěn)定后分別從取樣孔1、取樣孔2取3～10 mL樣品于離心管中放置在-80 ℃的冰箱中作為DNA分析的樣品。

根據(jù)E.Z.N.A.?soil試劑盒(Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)說明書進行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量；細菌擴增引物為338F (5’- ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R (5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)對V3-V4可變區(qū)進行PCR擴增。古菌的擴增引物為524F (5' - TGYCAGCCGCCGCGGTAA-3')對V4-V5可變區(qū)進行PCR擴增。擴增體系為20uL，4uL 5*FastPfu緩沖液，2uL 2.5mM dNTPs，0.8uL引物(5uM)，0.4ulFastPfu聚合酶；10ng DNA模板。擴增程序為：95℃預變性3min，27個循環(huán)(95℃ 變性30s，55℃ 退火30s, 72℃ 延伸30s)，最后72℃延伸10min (PCR儀：ABI GeneAmp? 9700型)。擴增產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, USA) 進行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。純化后再送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行Illumina MiSeq高通量測序。采用 Qiime軟件(version 1.17)和UCHIME對原始數(shù)據(jù)進行過濾、修剪并嵌合體序列。采用Uparse(version 7.1)進行運算分類單元(Operational Taxonomic Units，OTU)聚類分析(97%相似度)，并通過RDP Classifier(version 2.2)對OTU的代表序列作分類學分析(70%的相關(guān)系數(shù)閾值)。基于 OTU 聚類分析結(jié)果，采用Mothur軟件(Mothur v.1.30.1)對 OTU 進行多樣性指數(shù)分析[15]。

2 結(jié)果與討論

2.1 沼液回流對日產(chǎn)氣量及氣體成份變化的影響

快速穩(wěn)定的啟動對于一個厭氧反應器十分必要。為了縮短反應器啟動期的時間，在啟動階段(第1 ～18 天)采用100%的體積比沼液接種，同時根據(jù)日產(chǎn)氣量的情況逐漸增加進料量來保證快速穩(wěn)定的啟動。如圖2所示，反應器運行的前5天，產(chǎn)氣量一直處于較大的波動狀態(tài)，造成這樣現(xiàn)象的原因主要是接種物剛進入一個新環(huán)境，它有一個適應期和延滯期。有研究結(jié)果表明，產(chǎn)甲烷菌的水力停留時間要超過5 d之后才能夠開始利用揮發(fā)酸等營養(yǎng)物質(zhì)生產(chǎn)甲烷[18]。反應器從第6 天開始，日產(chǎn)氣量開始逐漸上升，直至第18 天達到38.19 L·d-1，容積產(chǎn)氣率達到了1.06 L·L-1d-1。從第19 天 到 46 天的運行，反應器的容積產(chǎn)氣率變化不大，在一定范圍內(nèi)進行波動，這表明反應器在第18 天時啟動成功，內(nèi)部的厭氧微生物已經(jīng)適應新的環(huán)境。

圖2 日產(chǎn)氣量變化曲線及每日沼液回流量

反應器在成功啟動后，進入穩(wěn)定運行期(第19 d～46天)，即每日不回流沼液到進料中。如圖2所示，反應器在穩(wěn)定運行期內(nèi)，日產(chǎn)氣量在35.93 L·d-1～45.96 L·d-1之間波動，平均日產(chǎn)氣量為40.79 L·d-1，但整體保持平穩(wěn)狀態(tài)。造成每日產(chǎn)氣量波動的原因主要是因為每日進料底物中營養(yǎng)物質(zhì)一直處于一個波動的狀態(tài)，造成產(chǎn)氣量產(chǎn)生波動。反應器從第47天開始，進料底物中每日回流進料量一半的沼液，從圖2中可以看出從回流沼液開始，日產(chǎn)氣量逐漸上升，直至第52 天，日產(chǎn)氣量達到峰值57.92 L·d-1(容積產(chǎn)氣率為1.61 L·L-1d-1)。從第53 天開始至運行結(jié)束，日產(chǎn)氣量在48.45 L·d-1～57.92 L·d-1之間波動，日均產(chǎn)氣量為52.52 L·d-1。相較于未回流沼液運行階段，日產(chǎn)氣量提升了28.76%。由此表明沼液回流能夠提高反應器整體的產(chǎn)氣量。在厭氧發(fā)酵過程中，底物的水解程度關(guān)系到整個發(fā)酵過程的效率，沼液回流能夠提升PFR厭氧反應器前端的微生物濃度，強化牛糞水解酸化效果進而提高沼氣產(chǎn)量。這與王文政[19]和盧艷娟[20]在研究沼液回流對玉米秸稈厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣性能影響和沼液回流對厭氧沼氣工程的影響時得出的回流對日產(chǎn)氣量無明顯作用的結(jié)果不太相同。

沼氣當中主要含有甲烷和二氧化碳。甲烷體積分數(shù)是衡量厭氧消化系統(tǒng)運行效率的基礎(chǔ)指標[12]。在反應器啟動的前5 d，甲烷的含量低于50%且波動較大(見圖3)。這是由于反應器啟動時氣室中充滿的是空氣，這些空氣會逐步隨著產(chǎn)生的沼氣排出，同時由于微生物處于適應期，消耗的營養(yǎng)物質(zhì)主要用于自身繁殖，因此沼氣中甲烷含量較低，而二氧化碳的含量較高。從第6 天開始，甲烷含量開始升高，到第11天時，甲烷含量達到60.75%。在反應器之后的運行直至停止運行，甲烷含量在58.32%～65.85%波動，日產(chǎn)平均甲烷含量為61.16%。而在沼液回流運行期間，每日產(chǎn)氣中的平均甲烷含量為61.15%。由此表明，沼液回流對產(chǎn)生的沼氣中甲烷含量并未有所影響。

圖3 日產(chǎn)沼氣中氣體成分變化情況

2.2 進料出料及取樣的pH值變化

在厭氧消化過程中，pH值是影響微生物生長的重要參數(shù)[21]。根據(jù)文獻報道，甲烷菌對 pH值較為敏感，其適宜生長的pH值范圍為 6.5～7.8之間[22-23]。如圖4所示，反應器每日進料的pH值在6.30～7.93波動，且波動較大。這主要是牛糞的pH值是波動的，造成每日進料的pH值變化。然而在沼液回流運行期間，進料的pH值在6.30～6.98波動。波動的范圍明顯縮小，這表明沼液回流可以對進料的pH值起到緩沖作用。進料的pH值變化變小，對反應器的穩(wěn)定運行極為有利。然而從出料的pH值可以看出，啟動期間出料的pH值在7.28～7.96波動，且在啟動后5 d，pH值逐漸趨于穩(wěn)定。這表明反應器在啟動階段，微生物從進入到新環(huán)境到逐漸適應的過程。從圖4中可以得出，運行階段出料的pH值波動很小，一直處于7.73～7.86波動。然而在第36 天出料的pH值為7.22，產(chǎn)生這種現(xiàn)象主要是由于PFR反應器的結(jié)構(gòu)特點，PFR的進料是先進先出，造成這一天pH值較大幅度降低是由于一個停留期前當天進料的pH值較低。底物經(jīng)過一個水力停留期發(fā)酵，盡管產(chǎn)甲烷的過程中pH值升高，但是由于水解酸化后的pH值較低，以至于出料的pH值也低。但該數(shù)值也在甲烷發(fā)酵的正常范圍內(nèi)。在沼液回流運行期，反應器的出料pH值一直處于較小幅度的波動，在7.18～7.34之間，這驗證了沼液回流能夠緩沖進料的pH值，進而影響出料的pH值浮動。同時也反映了反應器的穩(wěn)定運行狀態(tài)。從對反應器運行過程中取樣的數(shù)值可以看出，在啟動期和運行期的波動幅度較大，而沼液回流運行期，pH值的波動幅度較小。這說明沼液回流能夠起到緩沖運行過程中的pH值。

圖4 每日進出料及取樣的pH值變化情況

2.3 原料產(chǎn)氣率

反應器整個運行期內(nèi)干物質(zhì)的產(chǎn)氣率和揮發(fā)性有機物的產(chǎn)氣率及產(chǎn)沼率如圖5和圖6所示。在啟動期內(nèi)，揮發(fā)性有機物的產(chǎn)氣率在8.22 L·kg-1VS (7.06 L·g-1TS)～346.20 L·kg-1VS (294.29 L·kg-1TS)波動較大。主要是由于啟動期間原料的水力停留時間是從開始的1天增長到設(shè)計的20天，原料產(chǎn)氣率逐步提高；其次是在啟動期間微生物在進入新環(huán)境中還不穩(wěn)定。因此啟動期原料產(chǎn)氣率波動較大，并隨著啟動期的進行產(chǎn)氣率逐漸提高并穩(wěn)定。當反應器進入運行期，揮發(fā)性有機物的產(chǎn)氣率整體處于穩(wěn)定狀態(tài)，在平均值321.14 L·g-1VS (257.60 L·kg-1TS)上下波動。平均揮發(fā)性有機物的產(chǎn)甲烷率為196.52 L·kg-1VS (157.70 L·kg-1TS)。在反應器沼液回流運行期內(nèi)，揮發(fā)性有機物的產(chǎn)氣率在小幅度波動的下整體呈上升趨勢，在反應器運行到第96天 時，揮發(fā)性有機物的產(chǎn)氣率達到最大值502.78 L·kg-1VS (411.95 L·kg-1TS)。整個沼液回流運行期內(nèi)，平均揮發(fā)性有機物的產(chǎn)氣率為433.03 L·kg-1VS (366.99 L·kg-1TS)，平均揮發(fā)性有機物的產(chǎn)甲烷率為265.18 L·kg-1VS (224.66 L·kg-1TS)，相比未回流沼液的運行期的平均產(chǎn)氣率提升42.46%。這些結(jié)果說明，沼液回流能夠有效提升反應器內(nèi)底物的整體產(chǎn)氣效率。

圖6 每日原料產(chǎn)沼率變化曲線

圖5 每日原料產(chǎn)氣率變化曲線

2.4 原料降解率

圖7和圖8顯示的是牛糞厭氧消化過程總固體質(zhì)量和揮發(fā)性有機固體去除效率的變化情況。啟動期內(nèi)，反應器的出料是啟動時加入的沼液，這個時期的原料降解率在圖7～圖8中不能真實反應底物的降解效率。這是由于物料的先進先出，只有在經(jīng)過一個水力停留期之后，反應器的出料才能反映底物的降解程度。隨著反應器的啟動成功，運行期內(nèi)，總固體質(zhì)量的去除率呈大幅度波動且有下降趨勢，在12.45%～51.65%波動。平均每日的總固體質(zhì)量的去除率僅為31.15%。然而在進料中回流了沼液之后的運行期，總固體質(zhì)量的去除率呈小幅的波動，但總體呈逐漸上升趨勢。總固體質(zhì)量的去除率在33.24%～56.76%波動，平均每日的總固體質(zhì)量的去除率為47.25%。而且在反應器運行到第76 天，總固體質(zhì)量的去除率達到最大值56.76%。相較于未回流沼液的運行期，在沼液回流后平均的總固體質(zhì)量的去除率提升16.1%。揮發(fā)性有機固體去除效率呈現(xiàn)相同的規(guī)律，在無回流運行期平均去除率為31.15%。而在沼液回流運行期，平均去除率開始提升至48.99%。相較于未回流沼液的運行期，揮發(fā)性有機固體去除效率提高17.84%。這些結(jié)果進一步說明，沼液回流能夠提升底物的降解效率。Chen et al.研究沼液回流對牛糞厭氧發(fā)酵的影響也得到了沼液回流能夠增加原料利用率，提高厭氧發(fā)酵效率，增強系統(tǒng)運行穩(wěn)定性的結(jié)論[24]。

圖7 每日進出料總干物質(zhì)質(zhì)量及去除率

圖8 每日進出料總揮發(fā)有機物質(zhì)量及去除率

2.5 沼液回流運行期的微生物群落狀態(tài)

2.5.1 微生物多樣性

對Miseq測序所得不同取樣位置樣品的微生物16S rRNA基因進行統(tǒng)計分析，結(jié)果匯總見表 2。從表2可以看出每個樣品良好的文庫覆蓋度表明所測序列量已經(jīng)基本上可以完整反應該樣品實際序列信息。表征豐富度的ACE指數(shù)和 Chao1指數(shù)結(jié)果顯示反應器后部的細菌豐富度要稍高于前部的，而古菌豐富度前部要高于后部的。表征多樣性的Shannon和Simpson指數(shù)結(jié)果顯示，反應器后部的細菌的多樣性要高于反應器前部的，而古菌的多樣性則前后幾乎一樣。

表2 沼液回流運行期應器不同取樣位置樣品中微生物序列的統(tǒng)計分析結(jié)果

2.5.2 發(fā)酵料液中細菌群落組成分析

將細菌的各菌群豐度占比1%以上的9類菌門作圖(見圖9，圖10)，從門的分類水平進行分析，反應器中無論前段還是后段擬桿菌門厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)占比最高，總比例超過了75%。同時還有較小比例的互養(yǎng)菌門(Synergistetes)，綠彎菌門(Chloroflexi)，Parcubacteria門，變形菌門(Proteobacteria)以及疣微菌門(Verrucomicrobia)。同時在反應器的后部還富集了1.12%的螺旋體菌門(Spirochaetes)。這些細菌門均是牛糞厭氧消化體系中常見的優(yōu)勢細菌門[6,25]。主要負責牛糞的水解酸化等過程。Li[26]等研究結(jié)果顯示厚壁菌門和擬桿菌門是糞便和秸稈共消化過程主要的水解酸化菌。Paredes-Sabja[27]等報道厚壁菌門對纖維類物質(zhì)的底物有較強的降解能力。另外，李海紅[28]在研究中發(fā)現(xiàn)擬桿菌門有降解大分子碳水化合物產(chǎn)酸的功能。這些結(jié)果都表明，在本研究中的，經(jīng)過沼液回流后的反應器中富集了大量的降解牛糞中纖維類物質(zhì)的功能菌群，致使獲得較高的底物轉(zhuǎn)化效率。

圖9 反應器在沼液回流運行期取樣孔1樣品細菌在綱水平的分類組成

圖10 反應器在沼液回流運行期取樣孔2樣品細菌在綱水平的分類組成

圖11顯示了細菌在屬水平的組成。在反應器的前段和后段中，主要以厚壁菌門的梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium)為主。研究發(fā)現(xiàn)梭狀芽胞桿菌能夠產(chǎn)生蛋白酶、纖維素酶等有機物降解的酶類，它同底物轉(zhuǎn)化成揮發(fā)酸密切相關(guān)。同時梭菌除水解酸化外，還涉及產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸和乙酸氧化過程[29]。Weimer[30]等發(fā)現(xiàn)Clostridium能夠?qū)⒗w維素和半纖維素等大分子水解成葡萄糖。另外在反應器前后段還含有豐度相當?shù)腟edimentibacter屬,Proteiniphilum屬,Cloacibacillus屬,Parcubacteria_genera_incertae_sedis屬,Petrimonas屬,Ornatilinea屬,Syntrophomonas屬和Pelotomaculum屬。同時反應器前段相比于反應器后段還有一定量的Macellibacteroides屬,Aminivibrio屬和Phascolarctobacterium屬。這些細菌同樣在參與底物從大分子降解成小分子過程中起到重要的作用。例如，有文獻報道Sedimentibacter屬在物質(zhì)從產(chǎn)氫到轉(zhuǎn)化為甲烷的過程中起到連接的作用[31]。對于牛糞這種富含大量纖維類物質(zhì)的底物降解是一個復雜的代謝過程，需要多種功能微生物共同參與。而本文的研究結(jié)果顯示，回流沼液后的PFR厭氧反應器中富集了優(yōu)勢的降解牛糞原料為底物的功能微生物，同時又存在著多種的其他水解酸化微生物進行協(xié)同作用共同完成底物的有效降解，繼而獲得較高的產(chǎn)甲烷率。

圖11 反應器在沼液回流運行期取樣孔1，取樣孔2樣品細菌在屬水平的分類組成

2.5.3 發(fā)酵料液中古菌群落組成分析

古菌的各菌群豐度在門的分類水平上分析(見圖12，圖13)，產(chǎn)甲烷作用由一類特殊的微生物—產(chǎn)甲烷菌利用產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸階段的產(chǎn)物如乙酸，H2/CO2，以及甲酸、甲醇和甲胺類等簡單的有機化合物進行產(chǎn)甲烷的過程[12]。在反應器的前段中廣古菌門(Euryarchaeota)是絕對優(yōu)勢菌門，相對豐度為 75.32%。隨著底物從前向后推進，反應器的后段仍以廣古菌門為絕對優(yōu)勢菌種，相對豐度為68.41%。而在反應器的前端泉古菌門(Crenarchaeota)僅有14.16%的豐度，而在反應器的后段，泉古菌門得到了富集，相對豐度為26.65%。廣古菌門內(nèi)的成員被發(fā)現(xiàn)是普遍存在多種厭氧反應器中主要的產(chǎn)甲烷菌。而泉古菌門的成員在產(chǎn)甲烷過程中也起到重要的作用。

圖12 反應器在沼液回流運行期取樣孔1樣品古菌在綱水平的分類組成

圖13 反應器在沼液回流運行期取樣孔2樣品古菌在綱水平的分類組成

從圖14古菌屬的分類組成可以得出，在反應器的前段和后段的主要產(chǎn)甲烷菌屬為甲烷絲菌屬(Methanothrix)和甲烷螺菌屬(Methanospirillum)以及少量的甲烷桿菌屬(Methanobacterium),甲烷八疊球菌(Methanosarcina)和甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)。其中甲烷絲菌屬和甲烷螺菌屬的相對豐度含量超過了60%。而且在反應器的前部甲烷絲菌屬的相對豐度要高于反應器的后段。甲烷絲菌屬在前部的豐度為40.62%，相較于后部高1.23%。有文獻報道，甲烷絲菌是目前已知的僅有的兩種僅以乙酸鹽為能量來源、通過厭氧代謝生成甲烷而不利用氫氣和二氧化碳的產(chǎn)甲烷菌之一[32]。這主要是因為PFR的前端是底物的大量水解酸化的過程，生成大量的乙酸，因此會促使乙酸型產(chǎn)甲烷的富集。在底物大量水解為乙酸的同時，伴隨著氫氣的生成，因此促使了甲烷螺菌這種氫營養(yǎng)型甲烷菌在系統(tǒng)內(nèi)的富集，它是主要的利用H2和CO2產(chǎn)生甲烷菌屬。然而隨著底物逐步推向出料端，可水解的物質(zhì)多為難降解的大分子物質(zhì)，因此水解過程逐漸變?nèi)?，同時水解的產(chǎn)物也復雜多樣，因此甲烷菌群在以甲烷絲菌為絕對優(yōu)勢菌群外，另外混合營養(yǎng)型的甲烷八疊球菌、以及一些未分類的甲烷菌的豐度在升高，它們同樣在甲烷生成的過程中起到了關(guān)鍵作用。在專性產(chǎn)甲烷菌處于絕對主導地位的同時，含有兼性產(chǎn)甲烷菌，在這些產(chǎn)甲烷菌以及水解菌的共同作用下，使得反應器高效穩(wěn)定的運行。

圖14 反應器在沼液回流運行期取樣孔1，取樣孔2樣品古菌在屬水平的分類組成

3 結(jié)論

本研究利用牛糞作為發(fā)酵底物，考察了在PFR反應器厭氧消化的過程中回流50%的沼液對反應器的性能及底物轉(zhuǎn)化效率的影響。在沼液回流后，反應器的日產(chǎn)氣量最高達到57.92 L·d-1，容積產(chǎn)氣率達到1.61 L·L-1d-1。平均日均產(chǎn)氣量為52.52 L·d-1，平均揮發(fā)性有機物的產(chǎn)氣率為433.03 L·kg-1VS (366.99 L·kg-1TS)，相比于未回流沼液的運行期的平均干物質(zhì)產(chǎn)氣率提升42.46%，且平均甲烷含量為61.20%。同時在沼液回流運行期，底物降解率達到48.99%。通過對微生物群落的分析，細菌主要以厚壁菌門的梭狀芽胞桿菌屬和擬桿菌門的功能菌為主。古菌群落則以甲烷絲菌屬和甲烷螺菌屬為絕對優(yōu)勢菌屬?？梢?，沼液回流能夠顯著提升牛糞在PFR厭氧消化性能。另外沼液回流還能減少后續(xù)沼液處理量。這一結(jié)論為沼氣工程長期穩(wěn)定的運行提供理論參考。