蔡氏疣螈在中國的分布及補遺

李慧明 楊璧澤 池輝云 賴任燕 劉昌傳徐湛榮 朱秀芳 龔世平 陳金平*

(1.廣東省科學院，廣東省生物資源應用研究所，廣東省動物保護與資源利用重點實驗室，廣東省野生動物保護與利用公共實驗室，廣州，510260；2.廣東省云開山國家級自然保護區，信宜，525300)

1871年，Anderson將在云南龍川縣采集到的紅瘰疣螈(Tylototritonverrucosus)作為模式種建立了疣螈屬(Tylototriton)[1]。Dubois和Raffa?lli[2]基于形態特征將疣螈屬劃分為2個亞屬：瑤螈亞屬(subgenusYaotriton)和疣螈亞屬(subgenusTylototriton)。疣螈屬現存24個種。由于屬內種類形態特征相似，地理分布區域重疊，一些物種的有效性一直存在許多爭議[1，3-5]。隨著分子生物學方法的發展與應用，一些隱藏的生物多樣性被逐漸揭示出，一些新種被發現，一些被重新劃分或命名，也有同物異名被合并[6-7]。Wang等[6]在研究疣螈屬種類多樣性及其系統發生關系時，將這一進化支系中的24個種類均列入疣螈屬進行討論，基于2個線粒體基因(16S和ND2基因)和2個核基因(NCX1和BDNF基因)重建的串聯基因樹中將現存種類劃分為5個分支，并認為第4分支中細痣疣螈(Tylototritonasperrimus)種組存在隱種。

蔡氏疣螈首次被發現于越南北部的高平省的河江地區，曾被定種為Tylototritonasperrimus，Tylototritonvietnamensis和Tylototritoncf.vietnamensis[1，4，8-9]。后在中國云南麻栗坡縣被發現，但僅有線粒體基因組數據被報道，并沒有形態學描述[5]。從系統發生關系來看，蔡氏疣螈與分布在熱帶亞熱帶地區的海南疣螈(Tylototritonhainanensis)、老撾疣螈(Tylototritonnotialis)、細痣疣螈聚為一支[4]，屬于細痣疣螈種組。蔡氏疣螈目前主要分布于與越南北部河江和高平省，分布區域緊鄰越南與中國廣西邊界。

中國地理范圍跨度大，生境多樣性豐富，具有維持兩棲類種類多樣性的生態條件。廣東云開山國家級自然保護區地處廣東省西南部(111°08′19″—111°23′48″E，22°13′58″—22°21′24″N)屬亞熱帶濕潤季風氣候，為森林生態系統類型的自然保護區，具有較大面積完整的次生南亞熱帶常綠闊葉林和溝谷雨林，蘊藏著豐富的野生動物資源。疣螈多棲息于海拔650—2 500 m山區溪流或水塘邊，喜植被繁茂環境，云開山保護區為疣螈提供了良好的生存環境。目前，疣螈種類廣泛分布于中國中部和南部地區(廣東、廣西、四川、云南、貴州和甘肅省)。對疣螈的研究將使我們能從新的角度上認識分布區域的地理變遷和物種多樣性分化，對保護這一珍貴物種的遺傳多樣性提供重要的基礎數據。本研究對廣東省信宜云開山國家級自然保護區采到的疣螈標本進行形態學和分子生物學綜合分析，討論了蔡氏疣螈的分類地位。

1 材料和方法

1.1 標本的采集

2018年4月，在廣東省信宜云開山國家級自然保護區內一臨時性水坑(111°11′38″E，22°16′23″N)采集到6只疣螈標本(5只已死亡，1只活體)。將采集的標本帶回實驗室進行體長測量、形態特征鑒定及分子標記實驗。研究完成后將死亡個體存放于廣東省生物資源應用研究所標本館(編號：GIABR-A-U-2018-001，GIABR-A-U-2018-002，GIABR-A-U-2018-003，GIABR-A-U-2018-004，GIABR-A-U-2018-005)，1只活體帶回保護區進行放生。

1.2 ML系統發育樹重建

取6只疣螈尾尖少許肌肉作為DNA提取模板，以擴增獲得線粒體COI、Cytb、ND1和ND2基因序列，研究中所需的引物序列參考Zhang 等[10]。DNA提取方法按照美基生物(Magen)組織DNA小量提取試劑盒(Hipure Tissue DNA Mini Kit)流程操作。總反應體系為30 μL，反應條件：96 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸5 min，此過程進行35個循環；72 ℃延伸10 min。反應產物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用SYBR染色，并于凝膠成像系統紫外光下觀察電泳結果。序列的純化和測定工作由天一輝遠生物公司完成。所得ABI源文件用DNAstar 6.0雙向拼接而成，使用MAFFT v 6.81b[11]、Mesquite(Maddison，2009)[12]和Finch TV 1.5.0對序列進行編輯、排序、手工修改顯見的錯誤。獲得的片段在NCBI數據庫中搜索序列同源性。

利用RAXML v.8.1.24軟件[13]，以鎮海棘螈(Echinotritonchinhaiensis)為外類群，將ND1、ND2、Cytb和COI基因序列進行串聯分析，使用最大似然法(ML)重建12種疣螈的系統發生樹。選擇執行快速支持度分析并以搜索的GTRGAMMA為最佳模型，自舉檢驗1 000次。本研究中從NCBI數據庫中下載的12個疣螈種類的序列見表1。Figtree軟件查看樹圖。

表1 研究中從NCBI下載獲得的疣螈種類的序列號Tab.1 The downloaded sequences and numbers of Tylototriton species from NCBI database

2 結果

2.1 外部形態特征

2018年4月，于廣東省云開山自然保護區采集疣螈6只，5雌1雄。雄性個體全長為14.1 cm；雌性個體全長為11.8—12.5 cm，平均體長為(12.2±0.31)cm(n=5)。根據調查發現此種疣螈多分布在保護區海拔500 m以上樹林繁茂及布有水坑溪流區域，繁殖季節集中在水體中完成交配繁殖。

主要的形態特征(圖1)：身體周身黑色，軀干圓柱形略扁；頭部扁平，頭寬略大于或等于頭長；頭側脊棱明顯并向內彎曲；吻端平，鼻孔近吻端；無唇褶；脊椎突出，分節，肋骨結節突出；皮膚粗糙，身體兩側脊棱顯著突起且各具一排球形疣粒(14—16粒)，彼此分界明顯且排成縱行，僅唇部、指趾末端和尾腹緣光滑；頸褶清晰；尾腹鰭褶延伸至泄殖孔后緣，尾末端鈍尖；四肢纖細，后肢略長于前肢，5趾4指，沒有蹼，趾長順序為3>4>2>5>1；雄性泄殖孔豎長狀，內壁有小乳突，雌性泄殖孔略短隆起，無乳突；指、趾末端、泄殖孔周緣和尾下緣為橘紅色。

圖1 Tylototriton ziegleri外部形態特征Fig.2 The female morphology characteristics of Tylototriton ziegleri

2.2 聯合基因系統樹重建

基于ND1、ND2、Cytb和COI串聯基因序列重建了12種疣螈的系統發育ML樹(圖2)。ML系統發育樹主要分為兩支，其中本次采集發現的疣螈(SP1—6)與蔡氏疣螈聚在一支，這與傳統形態分類結果一致。因此，根據多重線粒體基因序列分析及外部形態特征鑒定，認為此次在云開山保護區發現的疣螈應為蔡氏疣螈，為中國廣東省新紀錄種。NCBI上傳序列號為MH664279-MH664302。

圖2 基于ND 1、ND 2、Cyt b和COI基因串聯序列重建12種疣螈的ML系統發生樹Fig.3 Maximum likelihood tree(ML tree)based on the ND 1，ND 2，Cyt b and COI gene for Tylototriton and related species

3 討論

疣螈是中國重要的有尾兩棲類動物，隨著生境的喪失和破碎化其遺傳多樣性和種類多樣性明顯降低，種群數量急劇減少，目前部分疣螈種類(細痣疣螈、鎮海棘螈、貴州疣螈Tylototritonkweichowensis等)為我國Ⅱ級保護動物。根據本次研究的形態學特征與多重線粒體基因序列比對鑒定此次于廣東省云開山國家級自然保護區內發現的疣螈應為蔡氏疣螈，是分布于中國疣螈屬中的第5個種，為細痣疣螈種組中的一種。目前蔡氏疣螈僅分布在越南北部河江省、中國云南省麻栗坡縣和廣東省云開山保護區。

細痣疣螈種組依托秦巴山系、大婁山系、大別山系、南嶺、粵桂山系及環北部灣山系分布[7]，其間仍有部分的盲點有待調查。曾有報道在云開山發現細痣疣螈的蹤跡，但此次調查并未采集到樣本，從分布特征來看，細痣疣螈與蔡氏疣螈可能出現同域分布，疣螈種類在此區域尚可存在更多的物種多樣性。根據疣螈屬種類系統發生關系，細痣疣螈、海南疣螈、老撾疣螈與蔡氏疣螈的親緣關系很近，且該分支處于系統樹基部，是較原始的一支[6，9，14]。說明疣螈在中國與周邊東南亞國家應存在顯著基因交流和遷移擴散，周邊國家的物種可顯著影響中國疣螈種類多樣性；另一方面目前蔡氏疣螈獨立的分布于與越南北部與中國云南東部、廣東西南部，三者間空白的分布區域(比如廣西、海南等地)也可能有此種的分布，僅是尚未被發現，待日后工作進一步調查。

近年來，隨著疣螈屬中新種和隱種的不斷發現，對錯誤種類鑒定同時進行反復的修訂，這說明疣螈種類外部形態特征相似，地理分布區域重疊對準確的種類鑒定帶來了巨大的困難[3，7]。目前，在《中國兩棲動物及其分布彩色圖鑒》一書[15]和Wang等[6]發表的文章中均已將瑤螈亞屬和疣螈亞屬并為疣螈屬進行討論，但尚有多數文獻中仍使用亞屬或種組來描述疣螈屬的劃分已不妥當。

因此在以后的工作中以重要外部形態特征為主，補充解剖學特征以及結合分子標記技術輔助鑒定手段是十分必要的。但是在使用不同的分子標記對基因序列進行比對及重建系統樹時，可能會出現不同或多個鑒定結果。在本研究中，當進行ND2基因序列比對時，搜索結果中則出現原序列與細痣疣螈和蔡氏疣螈均具有相同的相似度和覆蓋率。因此在選用分子生物技術手段輔助種類鑒定時，應選取較多分子標記進行補充，單獨的分子標記鑒定結果可能出現偏差。

致謝：感謝此次參與野外調查的所有專家、學者以及廣東省云開山自然保護區的工作人員，特別感謝廣東省生物資源應用研究所張亮、何向陽和李林妙博士對本研究中樣品采集、分子實驗及種類鑒定方面提供的幫助。