2015-2018年廣東省豬流行性腹瀉病毒M基因的遺傳進化分析

趙賢杰 ， 張天佑 ， 李 舜 ， 李桂珍 ， 謝宏林 ， 李康健 ，張 熙 ， 付 強，3 ， 馬春全,3 , 陳勝鋒

(1.佛山科學技術學院生命科學與工程學院 ， 廣東 佛山 528225 ； 2.廣州長隆野生動物世界 ， 廣東 廣州 511430 ； 3.佛山佛科院動物醫院有限公司 ， 廣東 佛山 528225)

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的一種急性、高度接觸性腸道傳染病，發病迅速、傳播速度極快。該病多發于冬春季節，但近幾年發生了變化，在天氣炎熱時也偶有發生[1]。該病的臨床表現主要以排黃色水樣稀糞、嘔吐、脫水，新生仔豬發病率及死亡率高為特征。至今，PEDV在中國、越南、美國、匈牙利、加拿大、法國等多個國家均有報道，給全球養豬業造成嚴重的經濟損失[2]。近年來，我國許多地區PEDV毒株均出現變異趨勢，使PED防制難度增加，導致該病在國內流行，造成仔豬大量死亡，經濟損失嚴重，威脅了我國養豬業發展[3-4]。

PEDV為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，存在分別由S基因、E基因、M基因和N基因編碼的纖突蛋白(Spike protein，S)、小包膜蛋白(Envelope, E)、膜糖蛋白(Membrane,M)、核衣殼蛋白(Nucleocapsid, N)4種結構蛋白[5]。其中M蛋白能誘導機體產生針對病毒的中和抗體，在病毒粒子組裝和出芽過程中具有重要的作用[6]。M基因PEDV毒株間高度保守，可以體現田間毒株的多樣性及其與臨床毒株之間的遺傳關系，對PEDVM基因的檢測和分析有助于了解目前我國PEDV流行毒株的流行類型，同時可以作為PEDV分子分群的重要依據[7-8]。近幾年廣東PED多發，疫苗保護率越發低下。因此，本試驗于2016年5月-2018年12月在廣東省部分地區發生嚴重腹瀉的規模豬場采集了45份因嚴重腹瀉而死亡的仔豬小腸樣品，檢測并鑒定了22份PEDV陽性病料，對其M基因進行克隆測序以及遺傳進化分析，探究廣東省PEDV的流行變異情況，以期為當地防控該病制定防制措施提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料樣品 45份疑似感染PEDV的仔豬小腸樣品采集自廣東省云浮、清遠等發生嚴重腹瀉的規?；i場。

1.2 主要試劑 TRIzol試劑,購自Invitrogen公司；PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、DL-2 000 DNA Marker、ExTaqDNA聚合酶、pMD19-T載體、DH5α感受態細胞，均購自寶生物工程(大連)有限公司；膠回收試劑盒,購自Axygen公司；氯仿、無水乙醇、異丙醇等試劑均為分析純，購自廣州鼎國生物技術有限公司。

1.3 引物設計 參考黃冬妮論文中PEDVM基因引物進行合成[9]，即M-F：5′- TCACTTGTCACCGGTTGTGT-3′，M-R：5′-GAGATAATGGCACCCGTTTG-3′,預期擴增產物大小為867 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 病毒總RNA的提取及RT-PCR擴增 將采集的小腸樣品反復研磨勻漿，按TRIzol試劑使用說明書提取其總RNA，反轉錄成cDNA，并以其為模板進行PCR擴增。擴增體系50 μL，PCR反應條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s、55 ℃ 35 s、72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃ 10 min。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 目的基因的克隆與序列分析 PCR產物經膠回收后克隆至pMD19-T載體中，重組陽性質粒由生工生物工程(上海)股份有限公司測序。將測序的PEDVM基因應用DNASTAR 5.0軟件與 GenBank登錄的參考病毒株比對分析，并應用MEGA7軟件進行系統進化樹分析。

2 結果

2.1M基因的RT-PCR擴增結果 對采集的45份仔豬小腸樣品采用RT-PCR擴增PEDVM基因，結果顯示，22份樣品擴增出867 bp的片段，與預期的M基因相符(圖1)。

圖1 PEDV M基因RT-PCR擴增結果

2.2M基因序列分析結果 按樣品采集地將22株廣東流行PEDV毒株M基因序列分別命名為：CH/GDQY/2015(廣東清遠)、CH/GDLD/2015(廣東龍洞)、CH/GDLC/2015(廣東龍川)、CH/GDLF/2015(廣東陸豐)、CH/GDQX/2015(廣東清新)、CH/GDZJ/2016(廣東紫金)、CH/GDGY/2016(廣東高要)、CH/GDHD/2016(廣東惠東)、CH/GDHS/2016(廣東鶴山)、CH/GDYF/2016(廣東云浮)、CH/GDYJ/2016(廣東陽江)、CH/GDXN/2016(廣東興寧)、CH/GDST/2017(廣東汕頭)、CH/GDHY/2017(廣東惠陽)、CH/GDHD/2017(廣東惠東)、CH/GDSH/2017(廣東四會)、CH/GDYD/2018(廣東英德)、CH/GDLC/2018(廣東龍川)、CH/GDQX/2018(廣東清新)、CH/GDZJ/2017(廣東紫金)、CH/GDGM/2018(廣東高明)、CH/GDZQ/2018(廣東肇慶)。

將獲得的22株廣東地區PEDV流行株M基因的測序結果與GenBank 中PEDV參考株M基因進行同源性分析(用于M基因序列比對的PEDV參考株見圖2)。結果顯示，22株廣東流行株間M基因核苷酸序列同源性為97.5%～100.0%，其中CH/GDZQ/2018與CH/GDZJ/2017、CH/GDGY/2016、CH/GDHS/2016的同源性最低為97.5%；CH/GDQX/2018 與CH/GDZJ/2017的同源性最高為100%。22株廣東流行株與華南地區參考株M基因核苷酸序列同源性為97.7%～99.9%，其中流行株CH/GDZQ/2018與參考株GDJM-1205的同源性最低為97.7%；CH/GDLC/2015、CH/GDSH/2017、CH/GDHD/2017分別與參考株CHN/SH、GDXS5的同源性最高為99.9%。此外，22株流行株與國內參考株LJB/03的同源性為96.9%～97.5%，與國內較早分離株CH/S和經典毒株的CV777的同源性分別為97.5%～98.1%、97.7%～98.2%；除了分離株CH/GDSH外，22株流行株與國內其他地區參考株的同源性為96.9%～99.7%。結果表明，22株廣東PEDV流行株的同源性較高，親緣關系緊密，而與經典毒株和國內較早分離株同源性較低。推測近年來廣東PEDV流行株可能形成獨特進化分支。

圖2 基于M基因的廣東省PEDV系統發育樹

將獲得的22株廣東PEDV流行株M基因測序結果與GenBank中的PEDV參考株M基因構建的遺傳進化樹結果顯示(圖2)，22株廣東PEDV流行株與部分國外毒株以及華南地區分離株均屬于II、III群，但是親緣關系較近，處于同一分支；與大部分均屬于I群的代表性毒株、疫苗株非一系，親緣關系較遠，如國內早期分離株CH/S、經典毒株CV777、韓國株KRPEDV-9-Vaccine、泰國株M_NIAH100541_08、日本株JMe2、英國株Brl/87等。以上結果均表明，近年來廣東PEDV流行株M基因發生基因變異，在廣東已成為優勢毒株，并發展形成獨特進化分支。

3 討論

典型的PED具有明顯的季節性，一般多發于冬春季節，但是近年來在天氣炎熱的時候偶有發生。我國在很長一段時間內通過免疫接種PEDV、TGEV和PRo V二聯疫苗或三聯疫苗來預防豬的腹瀉,取得了一定的效果。但自2006年開始,腹瀉滅活苗和弱毒苗廣泛使用的豬場也暴發了嚴重的腹瀉,給我國養豬業帶來的經濟損失較大[9-10]。本試驗通過對2016-2018年廣東省內各地分離得到的22株PEDV流行株M基因序列的遺傳進化分析，了解到廣東PEDV流行株存在基因變異的現象，形成了獨特的流行進化分支，為廣東省對PED的防制以及疫苗的研制提供理論依據。