改性纖維素納米微晶增強角蛋白載藥膜材料的制備及性能研究*

宋凱利，朱笑吉，朱衛明

(1. 浙江理工大學 生態染整技術教育部工程研究中心，杭州 310018;2. 浙江省清潔染整技術研究重點實驗室，浙江 紹興 312000)

0 引 言

角蛋白優異的生物學特性使得角蛋白膜作為藥物載體在傷口敷料、創口愈合材料等領域有突出的應用優勢[1-3]，作為藥物載體膜除了要求具有良好的藥物承載和釋放能力外，還需具有一定的力學強度，避免使用時材料受到破壞而出現爆發性釋放，以期具有穩定的使用性能和良好的藥物釋放能力[4-6]。角蛋白膜材料強度低，本課題組前期研究發現纖維素納米微晶可實現對角蛋白材料的力學增強，但會使膜的斷裂延伸性能有所下降，這就使得角蛋白膜材料的應用受到限制。這和纖維素納米微晶與角蛋白基體之間界面結合較弱有關，納米填料與基體材料之間的界面層作為復合材料一個重要的微結構[7-9]，不僅起著連接增強材料與基體的橋梁作用，也是外加負荷從基體向增強材料傳遞的紐帶，因此對復合材料的宏觀性能有重要的影響[10-13]。

有研究者為改善纖維素納米微晶與基體材料之間的界面結合，而對納米微晶進行改性。如Kim等人采用表面活性劑改變纖維素納米微晶的極性，從而提高其與疏水基體材料的界面結合[14]。Yu等人采用化學接枝改性來提高纖維素納米微晶與基質之間的結合力，從而提高復合材料的界面強度[15]。纖維素納米微晶表面的羥基具有一定的化學反應活性，可通過氧化反應將其氧化生成醛基，而醛基的引入則可賦予纖維素納米微晶一些特定的反應功能性[16-18]。引入的醛基可與角蛋白分子中氨基發生反應，生成化學交聯鍵，化學交聯鍵的建立有利于提高纖維素納米微晶與角蛋白基體相之間的界面結合，進而較好地改善復合材料的性能[19-20]。

在研究中，我們采用高碘酸鈉氧化法在纖維素納米微晶表面引入反應性官能團-醛基，得到醛基化纖維素納米微晶 (DCNC)。系統研究了纖維素納米微晶的氧化改性，將醛基化纖維素納米微晶作為增強體制備了角蛋白復合膜，詳細研究了復合膜的各項性能，探討了改性纖維素納米微晶對復合膜的增強增韌機制。將得到的性能最好的角蛋白復合膜材料為藥物載體，研究了其對包覆藥物的釋放行為。

1 實驗部分

1.1 實驗材料、藥品

纖維素粉：分析純，上海麥克林生化科技有限公司；硫酸：分析純，杭州高晶精細化工有限公司；冰醋酸：分析純，杭州高晶精細化工有限公司；尿素：分析純，上海麥克林生化科技有限公司；L-半胱氨酸：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 醛基化纖維素納米微晶的制備

硫酸水解法提取CNC：稱取1 g纖維素粉，緩慢加入50 mL 64%(質量分數)的硫酸溶液中，在溫度為45 ℃的水浴中水解55 min。反應結束后，將得到的混合液離心，收集離心所得固體產物，水洗4～5次。最后將CNC懸浮液裝入截留分子量為5000的透析袋中透析2天。采用高碘酸鈉作為氧化劑，在一定的物料比、溫度和時間下對纖維素納米微晶進行氧化改性。之后透析除去未反應的氧化劑。

1.3 角蛋白的制備

稱取10 g動物羽毛，溶解在8 mol/L的尿素溶液中，再加入對羽毛質量5%(質量分數)的L-半胱氨酸還原劑，浴比為1∶100，在85 ℃水浴中反應7 h，得到角蛋白懸浮液。將該懸浮液離心，收集上清液，裝入透析袋中，用大量去離子水透析2天。用等電點沉降法使角蛋白沉淀，并離心收集固體，冷凍干燥，得到角蛋白固體粉末。

1.4 醛基化纖維納米微晶增強角蛋白載藥膜的制備

稱取6 g角蛋白，溶解在94 g體積比為4∶1的醋酸/水溶液，超聲脫泡。在角蛋白制膜液中加入角蛋白質量5.0%的丙三醇增塑劑，采用溶液澆鑄法制備純角蛋白膜。改性纖維素納米微晶/角蛋白復合膜制備如下：將角蛋白溶液與改性纖維素納米微晶溶液按m(CNC)∶m(Keratin)為1%、2.5%、5%、10%的比例混合，攪拌均勻，倒入聚四氟乙烯制膜板上制膜。

慶大霉素是一種氨基糖苷類的廣譜抗生素，對多種陰性菌及陽性菌都具有較強的抑制和殺菌作用，用于小面積傷口處理具有防止傷口感染的效果，本實驗采用慶大霉素作為藥物模型測試角蛋白復合膜藥物緩釋性能。選用5.0%∶ DCNC/角蛋白復合膜為載藥膜基體材料，藥物包覆過程如下：在20 mL 5.0%(質量分數) DCNC/角蛋白制膜液中加入60 mg慶大霉素固體，攪拌溶解后倒入制膜板內待溶劑揮發得到包覆藥物的角蛋白復合膜。

1.5 醛基化纖維素納米微晶的表征

1.5.1 DCNC醛基含量的測定

醛基含量的測定原理為：采用鹽酸羥胺溶液與DCNC中醛基反應生成肟，同時生成鹽酸產物，使用標準氫氧化鈉溶液滴定生成的鹽酸，再通過消耗的氫氧化鈉體積反推出纖維素納米微晶上醛基的含量[18]。反應方程式如(1)所示:

(1)

在滴定之前先用標準氫氧化鈉溶液 (0.1 mol/L) 將配置好濃度為0.05 mol/L的鹽酸羥胺溶液pH值調至5，以除去鹽酸羥胺溶液中游離的鹽酸。準確稱取1 g凍干所得的醛基化纖維素納米微晶，置于100 mL燒杯中，加入50 mL去離子水，用氫氧化鈉溶液將上述懸浮液pH值調至5，之后加入精確體積的40 mL上述pH值為5的鹽酸羥胺溶液，在40 ℃下反應4 h，然后用標準氫氧化鈉溶液滴定上述反應液至pH值為5，平行做3次，記錄每次使用的標準氫氧化鈉體積，同時平行做3組空白對照 (使用相同質量的纖維素納米微晶作為空白組)。

1.5.2 DCNC形貌表征

采用SEM及TEM測試改性纖維素納米微晶的形貌。

1.6 醛基化纖維素納米微晶/角蛋白膜的測試與表征

1.6.1 DCNC/角蛋白納米復合膜的力學性能測試

將復合膜放在溫度為25 ℃，濕度為65%的環境下平衡24 h。然后用Instron3367萬能材料試驗機測試復合膜的拉伸性能，設定儀器參數為：夾距20 mm，拉伸速度20 mm/min。

1.6.2 DCNC/角蛋白納米復合膜耐水性能測試

將CNC/角蛋白復合膜放入烘箱干燥，稱重記為m1。在室溫下浸入超純水中3天，取出后烘箱烘干，稱量記為m2，按式(2)計算其質量溶失率：

(2)

1.6.3 DCNC/角蛋白納米復合膜藥物釋放性能測試

將制備的角蛋白載藥膜材料置于含50 mL不同pH值緩沖液的錐形瓶中，放在37 ℃的恒溫振蕩箱中在30 r/min下振蕩，間隔一定時間用移液槍取出3 mL溶液，同時補加3 mL緩沖液 (采用pH值為3和5的0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液以及pH值為7.4的0.1 mol/L PBS磷酸鹽緩沖液)。采用紫外可見分光光度計測定溶液中慶大霉素的含量，慶大霉素可與鄰苯二甲醛試劑發生衍生反應，反應物在332 nm處具有特性吸收，因此可通過紫外可見分光光度計檢測衍生物吸光度，繪制標準曲線計算慶大霉素含量。

2 結果與討論

2.1 DCNC的制備及表征

高碘酸鈉氧化纖維素是一種具有選擇性且副反應較少的氧化反應。纖維素分子中C6位羥基上的氫原子很容易與相鄰葡糖糖單元中氧原子形成氫鍵結合，而高碘酸鈉則主要進攻葡萄糖單元上的C2-C3位仲羥基，將其氧化為醛基。反應過程示意圖如圖1所示。

圖1 醛基化纖維素納米微晶制備過程圖Fig 1 Schematic illustrate the preparation of dialdehyde cellulose nanocrystal

氧化條件主要影響DCNC上醛基含量及其制備產率。圖2為不同反應條件對醛基化纖維素納米微晶上醛基含量和產率的影響。圖2(a)為高碘酸鈉與纖維素納米微晶的質量比對所得DCNC上醛基含量和產率的影響，隨著氧化劑用量的增加，所得醛基化纖維素納米微晶上醛基含量逐漸增加，直至氧化劑用量為微晶質量的1.5 倍時微晶上醛基含量達到最大值。醛基化微晶的產率則隨著氧化劑用量的增加呈現逐漸下降的趨勢，這是由于高碘酸鈉在氧化也會造成纖維素的氧化降解，造成醛基化纖維素納米微晶產率的下降。圖2(b)為反應溫度對醛基含量和產率的影響，隨著反應溫度由30 ℃升高至50 ℃時，醛基含量由1.6 mmol/g增加至2.7 mmol/g。從圖2(c)可知，氧化劑與微晶質量比為1∶1，反應溫度在40 ℃，反應時間為2 h的條件下，所得產物醛基含量為2.1 mmol/g，產率為78%。

圖2 高碘酸鈉用量，反應溫度及反應時間對醛基化纖維素納米微晶上醛基含量及產率的影響Fig 2 Effect of NaIO4 dosage, temperature and reaction time on aldehyde content and yield of dialdehyde cellulose nanocrystal

采用FT-IR對醛基化纖維素納米微晶進行結構表征，結果如圖3所示。未改性的纖維素納米微晶呈現典型的纖維素紅外特征譜圖，對比醛基化纖維素納米微晶的紅外譜圖，其吸收峰的位置和強度基本上沒有發生變化，只是在1 732 cm-1處出現了新峰，該峰為醛基的特征吸收峰，說明高碘酸鈉氧化后成功在纖維素納米微晶上引入了醛基。

圖3 醛基化纖維素納米微晶的紅外譜圖Fig 3 FT-IR spectra of dialdehyde cellulose nanocrystal

圖4為所得醛基化纖維素納米微晶的形貌及粒徑分布圖。從圖4(a)可知，DCNC形貌呈現典型的棒狀形態，由于凍干所得纖維團聚現象較為嚴重，不能清晰觀察單根纖維的形貌，因此采用透射電子顯微鏡對醛基化纖維素納米微晶進行形貌表征，如圖4(b)所示。醛基化纖維素納米微晶為棒狀或針狀形貌。如圖4(c)所示，所得醛基化纖維素納米微晶的平均粒徑在187 nm左右，其懸浮液如插圖所示呈現乳白色。

圖4 醛基化纖維素納米微晶的FE-SEM，TEM 圖以及粒徑大小分布圖 (插圖為醛基化纖維素納米微晶懸浮液照片)Fig 4 FE-SEM micrograph, TEM micrograph and particle size distribution of DCNC determined by dynamic light scattering (inset: digital graph of DCNCs suspension)

2.2 DCNC/角蛋白復合膜的制備及性能

醛基化纖維素納米微晶增強角蛋白基復合材料的制備如圖5所示。角蛋白制膜中加入相對于角蛋白質量的1.0%，2.5%，5.0%以及10.0%的醛基化纖維素納米微晶，超聲分散均勻后在聚四氟乙烯基板上制膜，待溶劑揮發完全之后，在80 ℃的烘箱中加熱1.5 h以促進醛基與角蛋白分子上氨基之間的反應，在醛基化纖維素納米微晶與角蛋白之間建立化學鍵結合。

圖5 醛基化纖維素納米微晶增強角蛋白復合膜的制備流程圖Fig 5 Schematic plot of the preparation process of dialdehyde cellulose nanocrystal reinforced keratin nanocomposites

通過添加醛基化纖維素納米微晶來改善材料力學性能，因此測試了復合材料的斷裂強力及斷裂延伸性能，結果如圖6所示。從圖中可知未添加DCNC的純角蛋白膜的力學性能較差，斷裂強力和斷裂延伸均較低，其斷裂強力只有2.7 MPa，斷裂延伸為11.0%。與純角蛋白膜相比，添加DCNC之后復合膜的斷裂強力均有較大的增加，DCNC添加量為1.0%時復合膜的斷裂強力提高至8.5 MPa，且隨著DCNC添加量增加復合膜的斷裂強力大大增加，直到添加量為5.0%時，復合膜的斷裂強力達到最大值為23.5 MPa，再繼續增加DCNC的用量后復合膜的斷裂強力出現下降趨勢。DCNC的添加較好的改善了角蛋白復合膜的斷裂強力，與CNC相比，DCNC的添加對復合材料的力學性能改善效果較為理想。

圖6 醛基化纖維素納米微晶增強角蛋白復合膜的力學性能Fig 6 Mechanical properties of dialdehyde cellulose nanocrystal reinforced keratin nanocomposites

圖7為DCNC/角蛋白復合膜材料動態力學性能測試結果。圖7(a)為DCNC/角蛋白復合材料的貯能模量隨溫度的變化趨勢，隨著溫度的升高復合材料的貯能模量在100 ℃附近開始出現下降趨勢，此溫度范圍為材料的玻璃化區域，材料的貯能模量在此溫度范圍內達到最大值，溫度低于材料的玻璃化轉變溫度時材料處于橡膠態，材料的貯能模量較小。添加不同量的DCNC后復合材料的貯能模量呈現增加趨勢，這與上述復合材料斷裂強力變化趨勢類似。復合材料貯能模量的增加，可能是由以下原因導致：(1)纖維素納米微晶本身具有較高的模量，因此作為復合材料的增強相能夠大大改善材料的力學性能，使得角蛋白復合材料的貯能模量也大大提高；(2)醛基化改性的纖維素納米微晶與角蛋白發生交聯反應，在纖維素納米微晶與角蛋白之間建立了化學鍵的結合，化學鍵的建立大大提高了增強相與基質相之間的界面作用力，因此，使得兩相之間界面強度大大提高。在DCNC本身的增強效果與強界面作用力的共同作用下，復合材料的力學性能得到了較為理想的改善效果，因此使得復合材料的貯能模量增加。

圖7(b)為DCNC/角蛋白復合材料損耗因子隨溫度的變化趨勢。從圖中可以看出添加DCNC之后復合材料的tanδ波峰向高溫方向發生移動。材料tanδ曲線的波峰表示材料的玻璃化轉變溫度Tg，添加DCNC之后一方面可與角蛋白分子鏈之間相互纏結，使得分子鏈的運動阻力增加，自由移動變得困難；另一方面DCNC與角蛋白分子之間交聯鍵的建立，也使得角蛋白大分子鏈的自由移動阻力增加，這兩方面的原因造成復合材料玻璃化轉變溫度Tg的提高。

圖7 醛基化纖維素納米微晶增強角蛋白復合膜的動態力學性能Fig 7 Dynamic mechanical thermal analysis of dialdehyde cellulose nanocrystal reinforced keratin nanocomposites

2.3 DCNC/角蛋白復合膜藥物緩釋性能研究

通過以上研究可知，采用DCNC增強可使得角蛋白膜材料的性能得到較好的改善，采用5.0%(質量分數)DCNC增強的角蛋白復合膜為載藥材料，與純角蛋白膜材料進行對比，以硫酸慶大霉素為藥物模型，研究了角蛋白基膜材料作為藥物緩釋載體的應用性能，結果如圖8所示。圖8(a)～(c)分別為角蛋白基膜材料在pH值為3、5和7.4的緩沖液中隨時間變化的累積藥物釋放率。從3張圖中可知，純角蛋白膜對藥物均呈現爆發性釋放，說明純角蛋白膜材料對包覆的藥物沒有持續緩釋的效果，這是因為角蛋白膜材料性能較差，在使用過程中容易發生破壞而使包覆的藥物突釋。這種藥物釋放規律的膜材料不能滿足作為傷口敷料材料對傷口持續給藥的要求。DCNC/角蛋白復合膜對包覆的藥物在60 h后仍有藥物釋放，說明復合膜材料能使包覆的藥物緩釋，在傷口敷料材料等領域具有潛在應用價值。

圖8 角蛋白膜材料在不同pH值條件下對包覆藥物的釋放性能Fig 8 Drug release profile of keratin films at different pH solution

3 結 論

本研究通過在纖維素納米微晶上引入反應性醛基官能團，利用醛基與角蛋白氨基之間建立化學鍵結合，來改善纖維素納米微晶與角蛋白之間的界面作用力。制備了一種力學性能較好的角蛋白復合膜材料，并且研究了復合膜材料作為藥物載體的使用性能。研究表明，高碘酸鈉與微晶質量比為1∶1，反應溫度為40 ℃，反應時間為2 h條件下所得醛基化纖維素納米微晶的醛基含量為2.1 mmol/g，產率為78%。TEM證明改性纖維素納米微晶的形貌為針狀，FT-IR證明氧化改性沒有破壞纖維素微晶的化學結構。當DCNC的添加量為5.0%時復合膜的斷裂強力可由2.3 MPa提高到23.5 MPa，斷裂延伸由11.0%提高至30.0%。 且DCNC增強的角蛋白復合膜對藥物呈現緩慢釋放的規律，DCNC/角蛋白復合膜在50 h后仍有藥物釋放，說明該復合膜材料具有較好的緩釋性。這種藥物釋放規律的載藥材料較適合作為傷口敷料材料應用。