吉林省龍井市牛東方泰勒蟲的流行病學調查

劉士煌，鄭添予，朱奕霏，吳保義，張 燕，金春梅，于龍政

延邊大學農學院，吉林延吉 133000

牛東方泰勒蟲病是由泰勒科、泰勒屬的東方泰勒蟲寄生在牛的紅細胞及淋巴細胞內的一種蜱傳性原蟲病。臨床表現為高燒，異常消瘦，貧血和體表淋巴結腫大等，嚴重情況下可將牛致死，對牛機體危害極大[1]。該病分布廣泛，有明顯的地域性，在俄羅斯遠東地區、韓國、日本、澳大利亞等國家及地區均有報道[2]，我國從1964年初次在貴州省被報導乳牛血液中發現牛東方泰勒蟲以來，我國各個地區也接踵報道了該病。1980年，關明浩等[3]首次報道吉林省存在牛東方泰勒蟲病，這種疾病的發現是從外地向集安縣引進的22 頭牛中，發現22 頭牛的染病率為100%，死亡率高達13.6%。隨著我省養牛業的普遍發展和流行，至今，吉林省各地區已有10個縣市均有牛東方泰勒蟲病的普遍流行[4]。

牛東方泰勒蟲裂殖子主要表面蛋白(MPSP)基因是泰勒蟲屬的一種保守性蛋白，在溫和性泰勒蟲屬中，該基因已成為流行病學調查和研究的標志性蛋白[5]。1995年，Kubota S 等根據MPSP 基因（p33/p32）設計了2 對引物，可擴增I 型和C 型p33/p32 基因，結合擴增產物的酶切分析，發現所研究的大多數牛東方泰勒蟲感染的犢牛都至少含有兩種不同型的混合感染。1996年，Kubota S 等根據水牛泰勒蟲基因，設計了另外一對引物，結合I 型和C 型p33/p32 基因對應的2 對引物，PCR 和擴增產物酶切分析日本和澳大利亞的瑟氏/水牛泰勒蟲，發現有4個不同的等位型（C 型、I 型、B1 型和B2型）。本試驗以牛東方泰勒蟲裂殖子主要表面蛋白基因(MPSP)為靶標，使用等位特異的PCR 方法，運用三對不同的等位特異型引物(Chitose C-、Ikeda I-和buffeli B-型)做PCR 檢測，對吉林省龍井地區的牛東方泰勒蟲的多態性進行分析，采用血涂片染色鏡檢法并結合PCR 方法，對牛東方泰勒蟲病進行分子流行病學調查。

1 材料與方法

1.1 引物的合成

依據Yu[5]文獻合成東方泰勒蟲擴增引物及基因分型引物，通用引物為Ts-U 和Ts-R；I-型分型引物為TS-R 和TS-I；C-型分型引物為TS-R 和TS-C；B-型分型引物為TS-R 和TS-B。

1.2 血液樣本的采集

樣品采自吉林省龍井市某牛場，頸靜脈無菌采集抗凝血，現場制備血液涂片，共采集53 份。

1.3 血涂片鏡檢

血液涂片，甲醇固定2 min，自然干燥，50 倍稀釋的姬姆薩原液（默克公司）浸染12 h，在光學顯微鏡下進行蟲體檢查。

1.4 DNA 的提取

按全血DNA 提取試劑盒（Takara 公司）操作說明書步驟分別提取53 份龍井牛的血液樣本中牛東方泰勒蟲基因組DNA。

1.5 PCR 擴增與分型鑒定

反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延 伸1 min，進行35個循環，最后72 ℃延伸7 mi n。反應條件為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，進行35個循環，最后72 ℃延伸7 min。PCR 擴增產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.6 統計學分析

運用SPSS 進行方差分析血涂片鏡檢結果和PCR 結果的結果分析。

2 結 果

2.1 血涂片染色鏡檢結果

53 份涂片經姬姆薩氏染色后，可在光學顯微鏡下觀察到牛紅細胞內的東方泰勒蟲體，紅細胞染色質呈淡紅色，蟲體包漿呈藍紫色，如圖1 所示。所采集的樣本中有15 份呈血液涂片鏡檢陽性，陽性率為28.30%（15/53）。

圖1 血液涂片姬姆薩染色鏡檢結果（×1000）

2.2 PCR 檢測結果

53 份龍井地區的血液樣本用引物Ts-U 和Ts-R進行PCR 檢測，其中17 份被檢測呈陽性，陽性率為32.08%（17/53）。部分血液樣本東方泰勒蟲PCR 檢測結果，如圖2 所示。

圖2 部分血液樣本東方泰勒蟲PCR 檢測結果

2.3 東方泰勒蟲基因型分析

對已挑選的陽性樣品，分別使用三對不同的等位特異型引物(Chitose C-型、Ikeda I-型和buffeli B-型)做PCR 檢測，結果表明：17個陽性樣品基因型屬C-型和I-型，C-型的陽性率和I-型的陽性率均為13.21%（7/53），而B-型僅為7.55%（4/53），且有兩種基因型的混合感染，B 型和I 型混合感染率為1.87%（1/53），B 型和C 型混合感染率1.87%（1/53），并且還存在兩個陽性未測出類型。圖3A 為部分陽性血液樣本東方泰勒蟲PCR C-型檢測結果，圖3B 為部分陽性血液樣本東方泰勒蟲PCR I-型檢測結果，圖3C 為部分陽性血液樣本東方泰勒蟲PCR B-型檢測結果。結果顯示，在吉林省延邊朝鮮族自治州龍井市牛東方泰勒蟲存在至少三種亞型，即T.orientalis C 型、T.orientalis B 型和 T.orientalis I 型。

圖3 部分陽性血液樣本東方泰勒蟲分型PCR 檢測結果

2.4 PCR 檢測結果與血涂片結果對比分析

53 份液樣本經PCR 檢測，其中17 份陽性，陽性率為32.08%（17/53），而鏡檢結果陽性為15 份，陽性率為28.30%（15/53）。部分血液樣本東方泰勒蟲PCR 檢測結果明顯高于鏡檢的陽性率，經統計學分析得出，差異極顯著（p＜0.01）。53 份血液樣本中，PCR 方法檢測的陽性率為32.08%(17/53) 明顯高于姬姆薩染色法檢測的陽性率28.30%(15/53)，其中有2 份在鏡檢中觀察認為陰性的2 份血液樣本經PCR 檢測后也為陽性，說明PCR 方法比姬姆薩染色鏡檢法更為敏感。

3 討論

牛東方泰勒蟲病是一種慢性、消耗性的寄生蟲病。牛感染東方泰勒蟲后經過一段的急性期，常進入慢性無臨床癥狀時期，成為牛東方泰勒蟲的攜帶者，牛在整個生命周期中可能會持續感染該蟲體、雖然，牛東方泰勒蟲病很少引起牛的死亡，但是，該蟲體長期隱匿于牛體內，嚴重影響到牛的生長發育和牛類產品的產量和質量，給養牛業帶來了嚴重的經濟損失[6]。牛東方泰勒蟲通過系統進化樹分析，存在十幾種基因型，目前只有C-型、B-型、I-型、Thai-型可以通過PCR 方法進行區分，其他基因型需要通過基因測序知道其分型，本試驗中未能通過PCR 檢測出的類型可能屬于C-型、B-型、I-型之外的一種基因型。

結果顯示，龍井市是牛東方泰勒蟲病的流行地區，存在至少三種MPSP 基因型，導致這種情況的原因可能是多數的長角血蜱都生活在山區的灌木叢中，由于龍井市的地區處于山區，非常適合長角血蜱的生長和繁育，所以龍井牛接觸長角血蜱的概率相對其他地區會比較大，從而非常容易感染牛東方泰勒蟲病。其次，可能由于畜舍環境衛生、消毒措施不到位，沒有專業防護手段，導致蜱進入畜舍內叮咬了牛從而感染。牛東方泰勒蟲病在該地區處于流行趨勢，且呈明顯上升趨勢，該病已經對其地區及周邊地區的養牛業造成了嚴重的威脅[7]，有關部門應當采取相應的措施進行有效的防治和預防該病的持續流行。