油污脅迫下土壤微生物群落結構對外源施用玉米秸稈生物質炭的響應

王金成， 井明博， 張紹鵬， 周天林， 劉光琇， 陳 拓， 吳勝偉

(1.隴東學院 生命科學與技術學院， 甘肅 慶陽 745000； 2.甘肅省高校隴東生物資源保護與利用省級重點實驗室， 甘肅 慶陽 745000； 3.甘肅省極端環境微生物資源與工程重點實驗室 中國科學院西北生態環境資源研究院， 甘肅 蘭州 730000； 4.中國石油天然氣股份有限公司長慶油田分公司第十一采油廠， 甘肅 慶陽 745000； 5.西安環發生物科技有限公司， 陜西 西安 710068)

當今環保領域石油污染土壤修復技術可采用物理法、化學法和生物法，其中生物法以其環境友好、成本低和大面積原位操作等特點因此受到環境科學工作者的廣泛關注[1]。然而，油污土壤場地生態修復效果易受土壤生物學及非生物學環境因素的影響[2]，其中土壤酶活性和微生物學特性等生物學環境因子是決定油污土壤場地生態修復效果的關鍵因素[3]。目前，中國北方油污土壤生態修復對象主要包括落地原油和清罐原油，由于土壤油污含量高低不一且無法人為控制，因此土壤初始油污濃度高低則成為限制生物修復效果的主要環境因素之一。

近年來，生物炭作為一種新型功能性土壤調理劑，以其高比表面積、強電子交換性和強大的吸附作用等特點能有效改善土壤理化性質、酶活性和微生物生長環境，從而提升土壤污染物降解速率因此受到國內外污染土壤修復領域科研人員的廣泛應用[4-5]。但目前有關生物修復時外源施用生物質炭的相關研究主要集中在重金屬污染土壤方面[6-8]，但有關利用生物質炭實施石油污染土壤生物修復技術的研究報道相對較少，且研究內容主要集中在不同生物質炭原材料、不同的裂解溫度和施用量對土壤石油污染物生物修復效果的影響等方面[6,9-10]。而有關輕重兩種油污濃度脅迫時植物修復過程中外源施用生物質炭的相關報道則相對較少。

為此，本研究利用隴東黃土高原地區資源極為豐富的玉米秸稈制備生物質炭，以本研究團隊之前報道的金盞菊(Calendulaofficinalis)為供試植物[2]，在長慶油田公司第二采油廠隴東污泥處理站進行了為期4個月的油污土壤場地修復試驗。研究了在輕重兩種油污濃度脅迫下外源施用玉米秸稈生物質炭土壤總石油烴(total petroleum hydrocarbons，TPH)去除率、酶活性及微生物群落結構的變化情況，目的在于：①分析探討重度污染時植物修復過程中外源施用玉米秸稈生物質炭能否有效增加土壤TPH去除率；②明確輕重兩種油污濃度脅迫時植物修復過程中土壤微生物群落結構和酶活性對外源施用玉米秸稈生物質炭的響應情況。本研究旨在為隴東黃土高原地區開展油污土壤場地生態修復工作提供新的技術方案和基礎數據資料。

1 材料和方法

1.1 供試油污土樣來源和試驗設置

場地修復地點位于甘肅省慶陽市馬嶺鎮長慶油田公司采油二廠隴東油泥處理站(東經107°22′19″，北緯30°36′15″)。本次試驗設置了輕度(5%)和重度(20%)兩種油污濃度污染土壤，輕度污染土壤為處理站在各井場所收集的落地原油污染土壤(TPH=5.08±0.39%)，而重度污染土壤則通過向TPH含量為40.75±2.86%清罐原油中添加落地原油污染土壤的方式配置而成。其中石油烴密度為0.926 g/cm3，烷烴含量58.67%，芳烴含量19.86%，膠質和瀝青質含量11.94%，其他組分占9.53%。澆水平衡2周后測得TPH含量分別為4.87±1.15%和21.94±1.06%，文中以設置濃度為標識。

試驗設置如表1所示，共計包括6個處理組，分別為輕度(TPH=5%)污染脅迫組(B5，J5，JB5)和重度(TPH=20%)污染脅迫組(B20，J20，JB20)以及2個對照組(CK5和CK20)。由西安環發生物科技有限公司負責修建束沿，深度為50 cm，大小為6 m×2 m，土層鋪設厚度為25—30 cm。輕度污染土壤容重和pH值分別為1.34±0.28 g/cm3和8.78±0.11，重度污染土壤容重和pH值則分別為1.63±0.52 g/cm3和9.05±0.15。包括對照組(CK)在內，每個油污濃度設置設3個重復，共計24個束沿修復池。試驗開始于2018年5月1日，結束于2018年9月1日，試驗周期為4個月，生物質炭施用量為5%，其中植物修復組(J5，JB5，J20和JB20)播撒金盞菊種子500粒，覆土厚度約為1 cm，每3 d澆水一次，使土壤田間持水量保持在65%左右。

表1 不同處理組設置

1.2 測定指標及方法

1.2.1 生物質炭制備 玉米秸稈清洗后105 ℃烘干(24 h)，粉碎至1～2 cm長的小段后在馬弗爐中350 ℃下缺氧裂解4.5 h，冷卻后過60目篩備用[10]。灰分含量和pH值分別為35.74±1.71%和7.07±0.05，將制備好的玉米秸稈生物質炭通過攪拌機與油污土樣進行充分攪拌以確保均一性。

1.2.2 土壤酶活性測定 土壤脫氫酶采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法測定，多酚氧化酶采用鄰苯三酚比色法測定，多酚氧化酶活性以1 g土壤中紫色沒食子素的毫克數表示[2-3]。

1.2.3 土壤微生物群落結構分析 委托北京百邁客生物科技有限公司。利用試劑盒(D5625-01，Soil DNA Kit，OMEGA，USA)提取土壤微生物總DNA。以341F/805R(341F引物: 5’-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG-3’；805R引物:5’-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3’)對總DNA進行PCR擴增[7]。擴增步驟:94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，重復5個循環；94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，重復20個循環；引入Illumina橋式PCR兼容引物，95 ℃預變性30 s，95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，重復5個循環。將PCR產物回收純化后，利用Illumina HiSeq 2500平臺進行土壤微生物高通量分析。

1.2.4 土壤TPH殘留量測定及TPH去除率計算 土壤TPH含量采用超聲—索氏萃取—重量法測定[10]。稱取5 g風干土樣于50 ml離心管中，加20 ml二氯甲烷后60W功率下超聲萃取15 min，4 000 r/min離心10 min，收集上清液至已恒重的燒瓶中，重復萃取3次后將全部上清液54 ℃旋轉蒸發至干，稱重。前后重量差即為土壤TPH含量。TPH去除率計算公式如下：

1.3 數據處理與計算

利用SPSS 19.0和R2.15.2對數據進行分析，用Origin 8.0和R 2.15.2作圖。對土壤TPH去除率、根際土壤酶活性、微生物群落多樣性及其相對豐度等指標的測定值進行單因素方差分析，多重比較采用Duncan法，在95%水平分析差異顯著性。為了解析輕重兩種油污濃度脅迫時上述指標對金盞菊修復時外源施用玉米秸稈生物質炭的響應情況。基于Bray-Curtis相異指數，使用“envfit”函數，經Mantel檢驗與不同處理組土壤微生物群落結構顯著相關的上述土壤環境指標擬合不同處理組菌群結構的非度量多維尺度(NMDS)排序圖。為防止樣點在各象限的分布發生移位，在擬合時對NMDS的排序軸進行旋轉，以確保NMDS第一軸能夠最大程度表征群落相異性的變異。不同處理組矩陣及矢量數據集分別用Bray-Curtis與Euclidean距離表示[3]。

2 結果與分析

2.1 輕重兩種油污濃度脅迫下金盞菊根際土壤TPH去除率對施用玉米秸稈生物質炭的響應

圖1為輕重兩種油污濃度脅迫下不同處理組土壤TPH去除率變化情況。F檢驗結果顯示，輕重兩種油污濃度脅迫下不同處理組土壤TPH去除率差異極顯著(p<0.01)。多重比較(Duncan，α=0.05)結果顯示進一步顯示，輕度污染時(TPH=5%)土壤TPH去除率依次為JB5(61.95±1.39%)>J5(49.59±2.14%)>B5(41.94±1.83%)>CK5(12.52±1.16%)(p<0.05)，其中JB5，J5和B5處理組與CK5相比土壤TPH去除率分別增加了4.95，3.96，3.35倍，表明輕度污染時3種處理方式均可有效增加土壤TPH去除率。重度污染脅迫時(TPH=20%)，土壤TPH去除率依次為JB20(56.44±1.89%)>B20(29.13±2.77%)>J20(20.90±2.36%)>CK20(5.91±1.05%)(p<0.05)，與CK20相比，JB20，B20和J20處理方式土壤TPH去除率分別增加了9.54，4.93，3.54倍，說明在重度油污時3種處理方式亦能顯著增加土壤TPH去除率，其中金盞菊+玉米秸稈生物質炭處理方式(JB5和JB20)在輕重兩種油污濃度脅迫時土壤TPH去除率均顯著高于其他處理組(p<0.05)。

注：不同黑色和白色小寫字母分別表示輕度和重度油污濃度脅迫下土壤TPH去除率在不同處理組間差異顯著(Duncan，α=0.05)；不同大寫字母表示輕重兩種油污濃度脅迫下土壤TPH去除率在不同處理組間差異顯著(Duncan，α=0.05)；橫坐標上不同處理的具體意思詳見表1。下同。

其次，就相同處理方式在輕重兩種油污濃度脅迫時土壤TPH去除率變化情況而言(見圖1)，重度污染時玉米秸稈生物質炭處理組(B20)和金盞菊單獨處理組(J20)土壤TPH去除率與其輕度污染時相比分別下降了30.54%和57.85%，原因可能是由于重度污染會增加土壤黏度、阻礙土壤呼吸，從而限制了生物質炭吸附作用和金盞菊的生長，進而引起了玉米秸稈生物質炭和單獨金盞菊處理方式土壤TPH去除率的顯著降低。此外，JB5和JB20處理組土壤TPH去除率在輕重兩種油污濃度脅迫時無顯著差異，說明油污濃度在一定范圍內的變化對金盞菊+玉米秸稈生物質炭處理方式土壤TPH去除率的影響相對較小。

2.2 輕重兩種油污濃度脅迫下金盞菊根際土壤酶活性對施用玉米秸稈生物質炭的響應

如圖2所示，不同處理組土壤脫氫酶和多酚氧化酶存在極顯著差異(p<0.01)。就輕重兩種油污濃度脅迫時CK組土壤脫氫酶活性而言，CK20組該酶活性與CK5組相比顯著降低了1.91倍，說明油污濃度增加對土壤脫氫酶活性存在顯著抑制作用。而本研究所設置的3個處理組而言，B5，J5，JB5處理組土壤脫氫酶活性在輕度污染時與CK5相比依次增加了1.90，2.47，4.59倍(p<0.05)，重度污染組B20，J20，JB20與CK20相比依次增加了3.12，2.25，8.87倍(p<0.05)，表明3個處理組在輕重兩種油污濃度脅迫下均能有效提高土壤脫氫酶活性。其中金盞菊+玉米秸稈生物質炭(JB)處理方式的土壤脫氫酶酶活性增加量在輕重兩種油污濃度脅迫時均顯著高于金盞菊單獨處理組(J)和生物質炭單獨處理組(B)(p<0.05)，說明金盞菊+玉米秸稈生物質炭處理方式在增加土壤脫氫酶活性方面明顯優于金盞菊和玉米秸稈生物質炭兩種單獨處理方式。

土壤多酚氧化酶活性方面，與CK5相比，JB5處理組土壤多酚氧化酶活性增加了5.97倍，而B5和J5處理組分別增加了2.45倍和2.66倍，說明金盞菊+玉米秸稈生物質炭處理方式在輕度污染組對土壤多酚氧化酶活性的促進作用相對較大。而重度污染時該酶活性高低依次為：JB20>B20>J20>CK20(p<0.05)，表明重度污染對金盞菊單獨處理組(J20)土壤多酚氧化酶活性有明顯抑制作用，這可能與重度污染對金盞菊生長產生了抑制作用有關。此外，重度污染時B20處理組土壤多酚氧化酶活性與輕度污染時B5和J5處理組無顯著差異則體現出生物質炭在改善土壤酶活性方面優勢明顯。綜上所述，金盞菊+玉米秸稈生物質炭(JB)處理組土壤脫氫酶和多酚氧化酶活性在兩種油污濃度脅迫下均遠高于其他處理組(見圖2)，因此隴東黃土高原地區實施油污土壤植物修復時可通過外源施用玉米秸稈生物質炭的來提高土壤脫氫酶和多酚氧化酶活性，進而加速土壤TPH的生物降解效率。

圖2 輕重兩種油污濃度脅迫下不同處理組土壤脫氫酶和多酚氧化酶活性變化情況

2.3 輕重兩種油污濃度脅迫下金盞菊根際土壤微生物群落多樣性對施用玉米秸稈生物質炭的響應

利用Illumina HiSeq 2500平臺對本研究所設置的不同處理組土壤樣品進行了細菌基因組DNA高通量分析測定，結果如表2所示。不同處理組土壤樣品測得有效序列數介于41 941.97～56 192.65之間，其中JB20和JB5處理組最高，B20，J5和B5處理組次之，兩個對照組(CK20和CK5)相對較低(p<0.05)，而不同處理組土壤樣品的測序覆蓋率均大于98%，說明本次HiSeq測序深度足夠。可操作分類單元(OTU)數量方面，輕度污染時不同處理組土壤微生物OTU數量高低依次為JB5>J5>B5>CK5(p<0.05)，而重度污染時則依次為JB20>B20>J20>CK20(p<0.05)。兩種油污濃度相較而言，重度污染組JB20，B20，J20，CK20與輕度污染組JB5，B5，J5，CK5相比土壤微生物OTU數量分別降低了3.06%，4.03%，32.67%和9.44%，表明重度污染對金盞菊處理組土壤微生物OTU數量的影響相對較高，而JB20和J5之間、B20和B5之間無顯著差異則說明外源施用玉米秸稈生物質炭可能是上述處理組土壤微生物OTU數量依然保持相對較高的原因之一。

表2 輕重兩種油污濃度脅迫下不同處理組土壤細菌基因組DNA測序數據統計及多樣性變化情況

其次，供試油污土壤微生物群落多樣性分析結果如表2所示。重度污染組JB20，B20，J20和CK20與輕度污染組JB5，B5，J5和CK5相比土壤微生物Shannon指數分別降低了5.78%，5.59%，28.85%，9.77%，說明與輕度污染相比重度污染對土壤微生物多樣性均不同程度產生了抑制作用，其中金盞菊(J)處理組下降程度尤為明顯(p<0.05)。微生物豐度方面，重度污染組JB20，B20，J20和CK20與輕度污染對應的不同處理組相比土壤微生物Chao1指數依次降低了21.51%，2.67%，42.82%，3.30%，說明重度污染后金盞菊處理組(J)和CK組的土壤微生物豐度明顯受到抑制。此外，B5與B20之間以及JB5和JB20之間土壤微生物豐度則無顯著變化，這可能與外源施用玉米秸稈生物質炭可有效吸附了土壤石油烴，進而減緩了石油污染物的毒害作用有關。

2.4 輕重兩種油污濃度脅迫下土壤微生物群落結構對外源施用玉米秸稈生物質炭的響應

在門分類水平上，供試油污土樣細菌歸屬于22個門，其中相對豐度>1%的優勢菌群主要包括變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)等14個門(見圖3)，上述14種優勢菌門在J5，JB20和JB5處理組的相對豐度均>1%，而J20處理組的芽單胞菌門、Saccharibacteria門和Armatimonadetes門相對豐度均<1%，說明重度污染對金盞菊單獨處理組上述3種優勢菌門存在明顯抑制作用，而B5和B20處理組Saccharibacteria門、硝化螺旋菌門、藍細菌門和Armatimonadetes門相對豐度均<1%，推測硝化螺旋菌門和藍細菌門相對豐度的降低可能與未種植金盞菊有關。上述結果說明不同處理方式下油污土壤微生物群落組成在門分類水平上存在明顯差異，而金盞菊根際分泌物和玉米秸稈生物質炭有效改善土壤養分可能是金盞菊+生物質炭處理組方式土壤優勢菌門數量最多的主要原因。

注：相對豐度數值由相應優勢菌門3個重復的相對豐度平均值計算得出。

此外，F檢驗結果顯示，上述14個優勢菌門相對豐度在不同處理間均存在極顯著差異(F變形菌門=35.184，F擬桿菌門=621.831，F酸桿菌門=453.569，F放線菌門=856.196，F綠彎菌門=922.821，F迷蹤菌門=17 040.240，F芽單胞菌門=6 083.961，F疣微菌門=6 384.355，F浮霉菌門=9 767.236，FSaccharibacteria門=4 251.712，F硝化螺旋菌門=31 698.331，F厚壁菌門=7 593.169，F藍細菌門=16 264.231，FArmatimonadetes門=187 653.106，p<0.01)。當油污濃度由輕度(5%)增至重度(20%)時，生物質炭處理方式(B)的變形菌門和厚壁菌門相對豐度分別降低了1.94%和4.51%(p<0.05)，但酸桿菌門和放線菌門相對豐度卻顯著增加了2.83%和2.56%(p<0.05)；金盞菊處理組(J)的變形菌門、迷蹤菌門、芽單胞菌門、硝化螺旋菌門和Armatimonadetes門分別降低了3.48%，3.17%，3.61%，1.45%和1.16%(p<0.05)，而擬桿菌門和酸桿菌門相對豐度卻顯著增加了2.10%和4.33%(p<0.05)；金盞菊+生物質炭處理組(JB)中僅變形菌門相對豐度下降了2.70%(p<0.05)，而擬桿菌門則顯著增加了1.08%(p<0.05)。上述結果中，除J20處理組與J5相比有5個優勢菌門相對豐度顯著降低外，生物質炭處理組的變形菌門和厚壁菌門以及金盞菊+生物質炭處理組的變形菌門相對豐度顯著降低，而酸桿菌門、放線菌門和擬桿菌門的相對豐度也隨之增加，且上述優勢菌門中存在大量的原油降解功能菌[11]，結合土壤TPH去除率變化情況來看(見圖1)，油污濃度的增加土壤微生物在門分類水平的相對豐度并不能簡單的理解為抑制作用，即隨著油污濃度增加土壤微生物群落結構會做出響應，各處理方式通過群落結構組成和數量變化來適應和消除土壤TPH的生態毒性，由此推測外源施用玉米秸稈生物質炭削弱了重度污染土壤石油污染物的生態毒性，進而驅動了土壤微生物群落結構發生改變，促進土壤石油污染物的生物降解。

在屬分類水平上，對所有供試土壤樣品相對豐度>1%的優勢菌屬分析結果如圖4所示，其中主要包括鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)，Saccharibacteria屬，赤桿菌屬(Erythrobacter)，厭氧繩菌屬(Anaerolineaceae)，黃色單胞菌屬(Xanthomonadales)和志津氏菌屬(Simiduia)等28種優勢菌群。

為了明確輕重兩種油污濃度脅迫下不同處理組土壤微生物群落結構在屬分類水平的響應情況，采用Euclidean距離法對供試油污土壤微生物優勢菌屬分進行系統聚類，結果如圖4所示。若在25.00至11.93相似水平截取，供試土壤可劃分為2個類群，其中類群Ⅰ為JB5和JB20處理組，而其他處理組則劃分為類群Ⅱ，說明在屬分類水平上金盞菊+生物質炭處理組(JB5，JB20)群落結構相似性相對較高；若相似水平在8.67至11.93截取，類群Ⅱ則進一步劃分為類群Ⅲ(J20，CK5，CK20)和類群Ⅳ(J5，B5，B20)，表明輕度污染對金盞菊處理組的影響相對較小，其土壤微生物群落結構在此相似水平與兩個生物質炭處理組相似性相對較高，而重度污染對其影響相對較大因此其土壤微生物群落結構與兩個CK組較為相似。當相似水平進一步在2.15至8.67截取，類群Ⅲ(J20，CK5和CK20)的進一步劃分結果則反映出J20處理組和兩個CK組之間土壤微生物結構亦存在顯著差異，表明雖然重度污染對金盞菊生物存在可能存在抑制作用，但與未做任何處理的CK組相比土壤微生物群落結構在屬分類水平的響應方式依然不盡相同。

注：熱圖中顏色深淺代表土壤微生物優勢菌屬的相對豐度大小，其數值大小由相應優勢菌屬3個重復的相對豐度平均值計算得出。

當油污濃度由輕度(5%)增至重度(20%)時，生物質炭處理組(B)的鞘氨醇單胞菌屬、食烷菌屬和迪茨氏菌屬相對豐度顯著降低了1.91%，1.86%和1.04%(p<0.05)，赤桿菌屬和諾卡氏菌屬相對豐度顯著增加了1.11%和1.01%(p<0.05)；金盞菊+生物質炭處理組(JB)的赤桿菌屬、食烷菌屬、短桿菌屬和Sulfuritalea屬相對豐度顯著降低了1.06%，1.12%，1.06%和1.28%(p<0.05)，志津氏菌屬、Salinimicrobium屬、迪茨氏菌屬、不動桿菌屬、Bryobacter屬、無色桿菌屬、溶桿菌屬和Alkanindiges屬相對豐度顯著增加了1.12%，1.43%，1.04%，1.56%，1.20%，1.31%，1.18%和1.02%(p<0.05)，不難發現生物質炭處理組(B)和金盞菊+生物質炭處理組(JB)優勢菌屬變化趨勢與門分類水平較為相似，即優勢菌屬的相對豐度做出響應，微生物群落結構發生改變，從而削弱土壤石油污染物的生態毒性。但與生物質炭處理組(B)和金盞菊+生物質炭處理組(JB)優勢菌屬變化趨勢不同的是金盞菊單獨處理組(J)中鞘氨醇單胞菌屬、黃色單胞菌屬、志津氏菌屬、Salinimicrobium屬、亞硝化單胞菌屬、假單胞菌屬、諾卡氏菌屬、鹽擬桿菌屬、短桿菌屬、Alkanindiges屬、Sulfuritalea屬和假黃色單胞菌屬受重污染影響其相對豐度分別顯著降低了3.42%，3.34%，2.06%，1.32%，1.09%，1.55%，1.11%，1.57%，2.39%，2.91%，1.85%和2.66%(p<0.05)，僅有Saccharibacteria屬和不動桿菌屬相對豐度顯著降低了3.55和3.64%。綜上所述，輕重兩種油污濃度脅迫時B5和B20土壤微生物群落結構相似性相對較高原因在于28個優勢菌屬中僅有5個屬相對豐度發生了顯著變化(p<0.05)，而重度污染脅迫后JB20處理組中有4屬相對豐度降低8屬相對豐度增加(p<0.05)，這可能是生物質炭參與的不同處理方式土壤微生物群落結構相似性相對較高的原因之一，而重度污染后金盞菊處理組土壤微生物中僅有2個屬相對豐度顯著增加，卻有12個屬相對豐度顯著降低(p<0.05)，原因可能是由于重度污染通過抑制金盞菊生長的方式影響了土壤微生物群落結構和組成。此外查閱文獻報道可見，J20處理組中12個相對豐度顯著降低的優勢菌屬存在大量的原油降解菌[11-12]，這可能是決定重度污染時金盞菊單獨處理組土壤TPH去除率相對較低的關鍵因素之一。

2.5 不同處理組在輕重油污濃度脅迫時土壤環境因子與土壤微生物群落結構的非度量多維尺度(NMDS)分析

為了解析輕重油污濃度脅迫時油污土壤生物學及非生物學環境因子對不同處理方式的響應情況。即本研究所測定7項石油污染土壤生物學環境指標在驅動不同處理組土壤微生物群落結構(屬分類水平)分異過程中的相對重要性。將Mantel檢驗與不同處理組土壤微生物群落結構顯著相關(p=0.05)的5項土壤環境指標擬合于不同處理組菌群結構的非度量多維尺度(NMDS)排序圖上(見圖5)，脅強系數(stress)為0.253 1。由圖5可見，本研究所設置的兩個對照組(CK5，CK20和J20)相對集中，主要分布在NMDS1和NMDS2的負半軸，而其余處理組則主要集中在NMDS1正半軸上，上述NMDS點集分布方式體現了輕重兩種油污濃度脅迫下不同處理方式土壤微生物群落結構在屬分類水平的差異。

注：僅有95%置信水平與不同處理組土壤微生物群落結構顯著相關的環境變量(p<0.05)擬合在NMDS排序圖上。

由擬合結果可見(圖5)，土壤脫氫酶(R2=0.821 4，p=0.007)、Chao1指數(R2=0.723 3，p=0.018)、多酚氧化酶(R2=0.685 7，p=0.024)和Shannon指數(R2=0.591 3，p=0.041)是決定J5，B5，B20，JB5和JB20土壤微生物群落結構分異于其他處理組的主要環境因子，而土壤TPH殘留量(R2=0.806 4，p=0.009)則是引起CK5，CK20和J20處理組土壤微生物群落結構不同于其他處理組的主要環境因子。對上述5項與不同處理組土壤微生物群落結構顯著相關的環境變量進行Pearson相關性分析結果顯示，土壤TPH殘留量分別與土壤脫氫酶(r=-0.906)，多酚氧化酶(r=-0.867)，Chao1指數(r=-0.906)和Shannon指數(r=-0.918)呈極顯著負相關關系(p<0.001)，表明CK5，CK20和J20處理組相對較高土壤油污含量是決定其土壤微生物群落結構不同于其他處理組。結合輕重兩種油污濃度脅迫下不同處理組土壤微生物α多樣性和酶活性變化情況來看，J5，B5，B20，JB5和JB20處理組以其相對較高的土壤脫氫酶、多酚氧化酶、Chao1指數和Shannon指數是驅動土壤微生物群落結構分異于其他處理組的主要環境因子。

3 討 論

3.1 輕重兩種油污濃度脅迫下土壤TPH去除率對外源施用玉米秸稈生物質炭的響應

油污土壤場地生態修復過程中土壤TPH去除率是直接評價修復效果的重要指標之一[1]。Saum等[13]利用牧豆樹(Prosopisjuliflora)對輕度油污土壤(TPH=2%)實施為期5個月的植物修復試驗時外源施用了玉米秸稈生物質炭，結果顯示牧豆樹單獨修復組(48.15±6.11%)和牧豆樹+5%玉米秸稈生物質炭處理組(51.82±6.52%)土壤TPH去除率并無顯著差異；Han等[14]利用黑麥草(Loliumperenne)和小麥秸稈生物炭在天津大港油田7.17%油污土壤實施了為期3個月的植物修復試驗，結果顯示黑麥草+5%小麥秸稈生物炭處理組土壤TPH去除率為36.08%，而黑麥草處理組則高達55.13%。上述試驗結果說明中低油污濃度時外源施用生物質炭處理方式與植物修復相比土壤TPH去除率并未表現出明顯促進作用，甚至略低于植物修復方式，這與本研究5%油污濃度脅迫時J5(49.59±2.14%)處理組土壤TPH去除率顯著高于B5(41.94±1.83%)的試驗結果基本一致(見圖1)。而Wang等[15]分析探討蘆葦秸稈生物質炭對9.62%油污土壤修復效果時指出土壤TPH去除率為46.92%，且輔以(NH4)2SO4和K2HPO4營養物質后土壤TPH去除率高達51.35%%；Zhen等[16]利用稻殼生物質炭聯合大米草(Spartinaanglica)對大港油田重度油污土壤(TPH=30%)實施為期40 d的生態修復試驗時指出，大米草單獨處理組土壤TPH去除率僅為19.11±2.14%，而大米草+5%谷殼生物質炭修復方式土壤TPH去除率為39.71±3.85%，這與本研究重度污染時(TPH=20%)金盞菊+玉米秸稈生物質炭處理組土壤TPH去除率56.44±1.89%，而金盞菊處理組僅為20.90±2.36%試驗結的變化趨勢基本一致(見圖1)。究其原因在于輕度污染對植物生長的抑制作用相對較小，因此植物可充分發揮其根際降解或吸收富集特性進而有效提升土壤TPH的降解和轉化效率[17]，但重度污染時植物生長受到抑制后其根際效應則明顯減弱，故而TPH去除率也隨之降低[18]。前人研究指出油污土壤外源施用生物質炭可有效改善土壤理化性質、調控土壤營養元素、優化微生物生長環境，加速石油污染物的生物降解[16]。但就本研究試驗結果來看，輕度污染時金盞菊處理組(J5)土壤TPH去除率明顯高于玉米秸稈生物質炭處理組(B5)，說明輕度污染時植物修復效果明顯優于生物質炭的處理效果，而重度污染時生物質炭調控油污土壤營養元素，改善土壤結構的特性則逐步顯現，表現為重度污染時玉米秸稈生物質炭處理組(B20)土壤TPH去除率明顯高于金盞菊處理組(J20)。此外，本研究所設置的金盞菊+玉米秸稈生物質炭處理組土壤TPH去除率在輕重兩種油污濃度脅迫時無顯著差異，原因可能是由于重度污染時外源施用生物質炭有效吸收了土壤石油污染物[19]，從而降低石油烴的生態毒性從而緩解重度污染對植物生長的抑制作用，進而有助于植物發揮其根際降解或吸收富集特性[16]，因此在重度污染時依然保持相對較高的土壤TPH去除率。

3.2 輕重兩種油污濃度脅迫下土壤酶活性對外源施用玉米秸稈生物質炭的響應

土壤石油污染物的生物降解需要多種土壤酶的參與，而氧化還原酶是決定土壤TPH生物降解的關鍵功能酶系，其中土壤脫氫酶和多酚氧化酶則是直接參與土壤烷烴和芳烴生物降解的主要關鍵限速酶[3]。Cao等[4]單獨利用小麥秸稈生物質炭實施1%多環芳烴污染土壤修復試驗時指出，土壤多酚氧化酶和脫氫酶活性分別顯著下降14.55%和5.15%；而Zhen等[16]研究結果顯示，稻殼生物質炭+大米草聯合處理組分別在10%，30%和50%油污濃度脅迫時與大米草單獨修復組相比土壤脫氫酶活性分別顯著增加了21.57%，25.35%和11.48%，但隨著油污濃度增加該酶活性總體上則逐步受到抑制。上述試驗結果與本研究結果基本一致，說明單純利用金盞菊或施用生物質炭對土壤脫氫酶和多酚氧化酶活性的促進作用相對有限，而金盞菊+玉米秸稈生物質炭處理方式對其酶活性的刺激作用相對較大。究其原因在于生物質炭主要通過吸附作用來降低土壤有機污染物濃度，進而間接刺激植物和微生物的活性實施生物降解[20]，因此在某種程度以一種保護作用的方式促進了植物根系和微生物生長、增加土壤肥力、穩定土壤結構，進而形成植物根系-生物質炭-微生物協同修復體系[21]，從而大幅增加土壤脫氫酶和多酚氧化酶活性來加速土壤TPH的生物降解[22]。此外，本研究所設置的輕重兩種油污濃度生物質炭處理組(B5和B20)土壤脫氫酶活性無顯著差異，這與Zhen等[16]研究結論不盡相同，這可能是油污濃度高低有關，即在生物質炭處理方式在一定濃度范圍內土壤脫氫酶活性受油污濃度的影響相對較少，而當油污濃度過高時該酶活性可能會受到抑制，而這一推測有待進一步驗證。

3.3 輕重兩種油污濃度脅迫下土壤微生物群落結構對外源施用玉米秸稈生物質炭的響應

石油污染物對土壤生態環境的影響首先表現為改變土壤微生物群落結構組成[23]，而處理方式不同和油污濃度差異可驅動土壤微生物群落結構發生改變[24]。Sutton等[25]研究指出油污土壤中優勢菌門主要包括變形菌門、厚壁菌門、放線菌門、酸桿菌門和綠彎菌門，而本研究CK5和CK20土壤微生物群落結構也印證了上述試驗結論(圖3)。Li等[26]分別采用雞糞生物質炭、小麥秸稈生物質炭和木材生物質炭實施油污土壤生態修復研究時指出，上述3種生物質炭可有效增加綠彎菌門、酸桿菌門、硝化螺旋菌門和厚壁菌門相對豐度，而變形菌門、熱微菌門(Thermomicrobia)和放線菌門相對豐度則顯著降低。而Zhen等[16]研究表明油污土壤單獨施用稻殼生物質炭后鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬、假單胞菌屬、Ohtaekwangia屬相對豐度顯著增加，聯合大米草后Aquihabitans屬、Solimonas屬、Arenimonas屬、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、噬氫菌屬(Hydrogenophaga)、小梨形菌屬(Pirellula)、豐祐菌屬(Opitutus)和硫桿狀菌屬(Thiobacillus)相對豐度亦得到了顯著提升，說明土壤微生物群落結構對生物質炭和植物修復的響應方式不盡相同，究其原因在于植物根際分泌物的化感作用和生物質炭改善土壤理化特性的作用機理不盡相同[27]。本研究中供試油污土樣細菌歸屬于22個門，而相對豐度>1%的優勢菌群共有14個門，其中J5，JB20和JB5處理組上述14個門的相對豐度均>1%，而B5和B20處理組Saccharibacteria門、硝化螺旋菌門、藍細菌門和Armatimonadetes門相對豐度均<1%，表明硝化螺旋菌門和藍細菌門相對豐度的降低可能與未種植金盞菊有關，這與Zhen等[16]和Visioli等[27]研究結論基本一致。而J20處理組的芽單胞菌門、Saccharibacteria門和Armatimonadetes門相對豐度均<1%則說明重度污染可能對金盞菊生長產生抑制作用進而影響了土壤微生物群落結構和組成。

在屬分類水平上，所有供試土壤樣品相對豐度>1%的優勢菌屬共28個，且輕重兩種油污濃度脅迫時不同處理方式包括CK組在內土壤微生物優勢菌屬相對豐度存在極顯著差異，表明土壤微生物群落結構對油污濃度變化的響應方式存在明顯差異。由圖4可見，輕重兩種油污濃度脅迫時生物質炭處理組(B5和B20)土壤微生物群落結構相對穩定，表現為28個優勢菌屬中僅有5個屬相對豐度發生了顯著變化，而重度污染脅迫后金盞菊處理組(J20)與輕度污染組相比(J5)，鞘氨醇單胞菌屬、黃色單胞菌屬、志津氏菌屬Salinimicrobium屬、亞硝化單胞菌屬、假單胞菌屬、諾卡氏菌屬、鹽擬桿菌屬、短桿菌屬、Alkanindiges屬、Sulfuritalea屬和假黃色單胞菌屬均顯著降低，說明重度污染對生物質炭處理方式土壤微生物群落結構的影響相對有限，但對植物根際效應的抑制作用尤為明顯，這可能是NMDS排序結果中J20處理組土壤微生物群落結構顯著分異于其他處理組的主要原因(見圖5)。而金盞菊+生物質炭處理方式(JB)應對油污濃度由5%增至20%，22個優勢菌屬中，僅赤桿菌屬、食烷菌屬、短桿菌屬和Sulfuritalea屬4個優勢菌屬相對豐度顯著降低，但志津氏菌屬、Salinimicrobium屬、迪茨氏菌屬、不動桿菌屬、Bryobacter屬、無色桿菌屬、溶桿菌屬和Alkanindiges屬8個屬相對豐度顯著增加，加之上述優勢菌屬中包括了大量原油降解功能菌屬[11-12,28-29]，體現了植物+生物質炭處理方式通過改變土壤微生物群落結構和數量，通過增加原油降解功能微生物種類和數量的方式來加速重度污染是土壤TPH的生物降解效率。

此外，本研究發現輕重兩種油污濃度脅迫下生物質炭處理組(B5和B20)土壤微生物群落結構組成差異相對較小，而金盞菊處理組(J5和J20)土壤微生物群落結構卻發生較大變化，且多數功能性微生物相對豐度均顯著降低。結合NMDS擬合結果(見圖5)可見，土壤脫氫酶、Chao1指數、多酚氧化酶和Shannon指數是決定J5，B5，B20，JB5和JB20處理組土壤微生物群落結構分異于其他處理組的主要環境因子，表明與生物質炭優化土壤結構和理化特性來改善土壤微生物群落結構的作用方式相比，重度污染時植物根際化感作用對土壤微生物群落的影響極其有限。

4 結 論

(1) 輕重兩種油污濃度脅迫時分別單獨施用玉米秸稈生物質炭和種植金盞菊處理方式土壤TPH去除率、土壤脫氫酶和多酚氧化酶活性相對較低，而金盞菊+玉米秸稈生物質炭處理方式上述指標在輕重兩種油污濃度脅迫時土壤TPH去除率分別高達61.95±1.39%和56.44±1.89%；與重度污染時金盞菊和玉米秸稈生物質炭單獨處理組相較而言，金盞菊+玉米秸稈生物質炭處理方式可顯著增加重度污染土壤TPH去除率。

(2) 重度污染對單純植物修復方式的抑制作用進而導致土壤微生物優勢菌門的結構組成和數量亦受到顯著影響。本研究所設置的金盞菊+生物質炭處理組和生物質炭單獨處理組在輕重兩種油污濃度脅迫下土壤微生物群落結構組成差異相對較小，但上述兩種處理方式間土壤微生物群落結構存在顯著差異，而金盞菊單獨處理組土壤微生物群落結構則發生較大變化，且多數功能性微生物相對豐度顯著降低。

(3) 黃土高原隴東地區油污土壤實施場地生態修復時，輕度污染時金盞菊單獨處理方式和金盞菊+玉米秸稈生物質炭聯合處理方式均可有效增加土壤TPH去除率，但在重度污染時建議采用金盞菊+玉米秸稈生物質炭聯合處理方式，即應對輕重兩種油污濃度脅迫時玉米秸稈生物質炭均可作為土壤調理劑來提升修復效果。