兔源不動桿菌的分離與鑒定

陳曉蕾 陳 榮 黃瑞玲 李丹琦 屈貴蜀 彭瑤順 王全溪＊

（1.福建農林大學動物科學學院（蜂學學院） 福州 350002；2.閩南師范大學生命科學學院 福建漳州 363000）

不動桿菌（Acinetobacter spp.）屬于變形菌綱，廣泛分布于自然界，健康動物的皮膚、胃腸道以及呼吸道中均存在[1]。不動桿菌為機會致病菌，當機體抵抗力低下或長期服用免疫抑制類藥物時，容易引起機體感染，可引起敗血癥、呼吸道感染以及傷口感染等，重癥者可導致死亡[2]。

近年來，從流產胎豬[3]、牦牛[4]、梅花鹿[5]、禽[6]和山羊[7]中分離到不動桿菌均有報道與研究，對于兔源不動桿菌報道極少。福建某兔場，患兔表現鼻炎，鼻涕呈黏稠的白色狀，精神不振，食欲低下，毛發凌亂，經采集鼻腔黏液分離得到一株不動桿菌，對其敏感藥物進行了篩選，研究結果可為兔不動桿菌的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試驗動物 LB肉湯培養基、LB營養瓊脂購自生工生物工程（上海）股份有限公司；麥康凱瓊脂購自廣東環凱微生物科技有限公司；伊紅美藍瓊脂、革蘭氏染液購自北京索萊寶科技有限公司；藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；細菌生化微量鑒定管購自杭州天和微生物試劑有限公司；麥克奧迪BA210生物顯微鏡。20只6周齡SPF級雄鼠，體重20 25 g，購自福建醫科大學實驗動物中心；5月齡健康雄兔，體重2 3 kg，購自福建某兔場。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離與純化 無菌采集的患兔鼻黏液接種于LB肉湯培養基中，37℃增菌培養12～24 h后于LB營養瓊脂培養基上劃線培養，并置于37℃恒溫箱中培養24 h。從LB營養瓊脂培養基上分離到較為單一的菌落，選取單個菌落，連續傳代接種于伊紅美蘭瓊脂培養基。挑取藍色單個的菌落，革蘭氏染色后，鏡檢觀察。使用60%甘油與含有鑒定菌的肉湯培養物1：1混勻保種，備用。同時，取所分離純化的菌，接種于血瓊脂培養基和麥康凱瓊脂培養基，培養條件同上，觀察其生長特性。分離純化的病原菌編號為FJ01。

1.2.2 生化鑒定 用接種環挑取純化的菌落接種于葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、阿拉伯糖、甘露醇、西蒙氏枸櫞酸鹽、硫化氫、尿素酶、半固體瓊脂、硝酸鹽還原、氧化酶和賴氨酸脫羧酶生化鑒定管中，37℃培養24～48 h后觀察結果。

1.2.3 PCR檢測以及測序分析 提取細菌16S DNA為模板，設計PCR引物[8]，上游引物：5'-CCTGAATCTTCTGGTAAAAC-3'， 下游 引物 ：5'-GTTTCTGGGCTGCCAAACATTAC-3'，對分離菌進行PCR擴增。PCR反應體系為25 μL，加入PCR MasterMix 12.5 μL，Nuclease-FreeWater 9.5 μL， 上、下游引物各1 μL，模板1 μL。PCR產物送至生工生物工程 （上海）股份有限公司測序，測序結果提交至NCBI的BLAST分析比對，并采用MAGE6.0軟件的鄰接法構建系統進化樹。

1.2.4 藥敏試驗 采用K-B紙片擴散法[9]對分離菌進行藥敏試驗。挑取純化的單個菌落接種于LB肉湯培養基中培養24 h，取適量菌液在LB瓊脂培養基上涂板，待菌液稍干后用滅菌的鑷子貼藥敏片，37℃恒溫培養箱中培養24 h，測量抑菌圈直徑。

1.2.5 動物試驗 挑取純化的單個菌落接種于普通肉湯中培養12 h，采用紫外分光光度法測得菌液濃度為1.08×109cfu/mL。將小鼠分為試驗組和對照組，每組各5只。試驗組小鼠腹腔注射菌液0.5 mL，對照組注射滅菌生理鹽水0.5 mL，觀察12 h。同時，使用霧化噴鼻的方式接種菌液2 mL于健康兔鼻腔，觀察14 d。

2 結 果

2.1 細菌的培養特性和鏡檢結果 病原菌增菌后接種在LB肉湯瓊脂培養基上置于37℃恒溫培養箱中培養24 h，菌落圓形，邊緣整齊，光滑，濕潤，灰白色。挑取典型菌落進行革蘭氏染色，在光學顯微鏡的油鏡下觀察，該菌為革蘭氏陰性菌，形態為球桿狀，呈雙排列（見圖1）。該菌在伊紅美蘭瓊脂培養基上長出藍色帶金屬光澤菌落；在血瓊脂培養基上呈灰白色，未出現溶血情況；在麥康凱瓊脂培養基上長出灰白色菌落。

2.2 生化試驗結果 該菌發酵葡萄糖和麥芽糖，產酸不產氣，結果見表1。可見分離菌的生化試驗結果與不動桿菌基本一致。

表1 分離菌的生化試驗結果

2.3 PCR檢測以及測序分析結果 PCR檢測結果表明，目的基因片段大小為425 bp，由圖2可知，目的條帶位置與預期結果一致。將獲得的基因序列進行測序并比對，結果顯示該分離菌為不動桿菌。該分離菌與不動桿菌屬同一分支，同源性達97.3%；與鮑曼不動桿菌親緣性較近，同源性為95.5%；與約氏不動桿菌、溶血不動桿菌、醋酸鈣不動桿菌、洛菲不動桿菌等親緣性較遠（見圖3）。

2.4 藥敏試驗結果 由表2可知，該分離菌對青霉素類、頭孢呋辛、復達欣、苯唑西林等抗生素耐藥，對四環素、哌拉西林、美滿霉素和慶大霉素等抗生素敏感性較強，對其他抗生素處于中度敏感或敏感。

2.5 動物試驗結果 以濃度為1.08×109cfu/mL的純化菌液腹腔注射試驗組小鼠，6 h內小鼠出現精神抑郁、被毛凌亂、飲食減少、呼吸急促、腹部抖動等情況，12 h內5只小白鼠均死亡。剖檢死亡小鼠，可見十二指腸腸壁變薄，脹氣，肝臟呈暗紅色。空白對照組小鼠無上述癥狀。無菌采集試驗組小鼠的心血，接種于LB肉湯培養基中，37℃恒溫培養12 h，對其進行鑒定，證實為不動桿菌，結果表明分離菌為致病性菌，并有較強的致病性。使用霧化噴鼻的方式將菌液接種于兔鼻腔內，7 d后兔出現輕微癥狀，打噴嚏，流鼻涕，毛發凌亂，采集鼻腔黏液分離得到并鑒定為不動桿菌，結果表明不動桿菌是導致兔患病的病原菌，可以使兔患鼻炎。

3 討 論

不動桿菌存在于自然界中，是一種機會致病菌，在動物機體免疫力低下時易感染。目前國內外報道，該菌可引起豬肺炎[10]、烏龜腹甲和背甲潰爛[11]、雛雞死亡[12]和泥鰍皮膚黏液脫落[13]等。本研究從患兔的鼻腔黏液中得到分離菌，并結合培養特征、形態特征、生化試驗和特異性基因檢測，最終確定分離菌為不動桿菌。

該菌具有復雜的耐藥機制，對多數抗生素呈現天然耐藥性，并且對很多敏感的藥物可迅速產生一定的耐藥性[14]。藥敏試驗結果表明，該菌對頭孢呋辛、青霉素類、復達欣、苯唑西林、麥迪霉素和復方新諾明等抗生素耐藥，呈耐藥趨勢。不動桿菌具有獲得性耐藥能力，臨床治療時應該注意抗生素的選擇，避免耐藥性的產生。蔡香菊等[15]、趙娜等[16]和李凱旋等[17]研究表明，五倍子、黃芩和黃連等中藥對不動桿菌有較好的抑菌效果，我國的中藥資源豐富，且中藥抗菌譜廣、副作用小，近年來使用中藥抑制不動桿菌的研究不斷增多，中藥或許將成為預防和治療不動桿菌的重要途徑。

表2 分離菌的藥敏試驗結果