運動療法對STZ誘導的糖尿病大鼠病理損傷及骨骼肌FOXO1、GLUT4表達的影響

張新霞，謝 超，王志強，高 泓

隨著經濟的發展，人們的飲食結構發生著巨大的變化，糖尿病(diabetes mellitus，DM)成為一種十分常見的疾病[1]。目前我國大約有9500萬DM患者[2]。研究[3]表明：每周進行1次以上的運動者糖尿病的發病率減少。運動可以調節內分泌代謝并且使得肌肉利用葡萄糖和游離脂肪酸，有效抑制餐后血糖的升高，實現調節血糖的作用。糖尿病患者多運動不僅可以增強其代謝能力，還可以降低血酮體[4]。王宏[5]的研究表明：運動還能增加體內的免疫功能，改善腦細胞的活性，增強機體對血糖的調節能力。該研究旨在探討運動療法對鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)誘導的糖尿病大鼠病理損傷及骨骼肌FOXO1、GLUT4表達的影響，以期了解運動療法對STZ誘導的糖尿病大鼠病理損傷及骨骼肌FOXO1、GLUT4表達的影響作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物SPF級雄性Wistar大鼠75只，購自北京維通利華公司；動物許可證號SCXK(京)2017-0022，飼養于成都中醫藥大學附屬醫院動物中心實驗室。

1.2 藥物與試劑鏈脲佐菌素(純度>99.9%，CAS號：18883-66-4)購自上海翊圣生物科技有限公司；白細胞介素-6 (interleukin-6, IL-6)、白細胞介素-10 (interleukin-10, IL-10)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)試劑盒子購自美國Sigma公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA) 、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒均購自上海恒遠生物科技有限公司；半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-9(Caspase-9)抗體購自武漢華聯科有限公司；甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白-膽固醇(low density lipoprotein, LDL)及高密度脂蛋白-膽固醇(high density lipoprotein, HDL)試劑盒均購自北京中生生物試劑公司；蘇木精、伊紅購自武漢博士得生物有限公司；中性福爾馬林、酒精、二甲苯購自天津科密歐有限公司; TRIzol 試劑購自Thermo Fisher公司。

1.3 儀器全自動生化分析儀(型號：Sysmex-chemix-180)購自日本Furuno Electric公司；蛋白電泳及轉膜儀購自美國Bio-Rad公司；電子天平(型號：BS-124s)購自北京賽多斯儀器系統有限公司；臺式離心機(型號：TDL-5)購自上海安亭科學儀器廠；光學顯微鏡購自東莞市同創儀器有限公司；切片機購自德國Leica公司；低溫離心機購自湖南恒諾離心機有限公司。

1.4 方法

1.4.1建立模型 按照俞韓 等[6]研究方法。將所有大鼠適應性喂養1周后，禁食1 d。將鏈脲佐菌素(STZ)溶解于檸檬酸的緩沖溶液中，調節pH值，使pH值保持在4左右，將配置好的STZ溶液從大鼠的尾部靜脈注射，其注射量為55 mg/kg，若有死亡及時補充。36 h后測空腹血糖(fasting blood-glucose, FBG)，當血糖含量≥16.7 mmol/L時可以認為模型建立成功。

1.4.2分組及干預 將75只大鼠采用隨機數字表法分為:健康對照組、模型組、低強度運動組、中等強度運動組和高強度運動組，每組各15只。其中健康對照組不做任何處理，正常飼養；除了健康對照組以外的60只大鼠全部制成糖尿病模型；其中模型組大鼠采用自由活動，低強度運動組所有大鼠采用低強度運動，中等強度運動組大鼠采用中等強度運動；高強度運動組采用高強度運動，所有大鼠每天運動1 h，每周6 d，連續干預28 d。具體運動方式和運動程序參考Fernando et al[7]方法：采用跑臺運動，適應性訓練3 d，休息1 d后正式訓練。低強度運動組跑速10 m/min(相當于30%最大耗氧量)、中強度普通運動組跑速15 m/min(相當于50%最大耗氧量)、高強度運動組跑速20 m/min(相當于70%最大耗氧量)，坡度均為0。

1.4.3檢測項目

1.4.3.1 HE染色觀察大鼠腓腸肌 HE染色觀察各組大鼠腓腸肌，使用二甲苯浸泡、不同梯度酒精脫水、蘇木精浸泡、鹽酸酒精分化、沖洗、伊紅染色、酒精浸泡、二甲苯浸泡，最后中性樹膠封片、觀察。

1.4.3.2 蛋白質印跡法檢測蛋白表達水平 取大鼠大鼠腓腸肌，使用剪刀剪碎后使用濾網過濾，制成懸液，使用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳提取總蛋白，半干法將蛋白轉移到PVDF膜，置于5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后加入各需要檢測蛋白的一抗、二抗，孵育2 h，TBS洗凈，以GAPDH為內參蛋白，采用顯色液顯色后行吸光度分析，計算各蛋白相對表達量。

1.4.3.3 生化指標檢測 嚴格按照全自動生化檢測儀使用方法檢測大鼠血清TG、TC、LDL、HDL含量變化。

1.4.3.4 ELISA法檢測大鼠炎癥因子 從大鼠頸總動脈插管接取0.5 ml血液，按照試劑盒說明書檢測大鼠血清中的IL-6、IL-10及TNF-α含量。

1.4.3.5 生物化學方法測定 使用黃嘌呤氧化酶法測定大鼠骨骼肌組織中SOD的活性[8]；使用硫代巴比妥酸法檢測大鼠病骨骼肌組織中MAD含量[9]；使用生化法檢大鼠病骨骼肌組織中LDH含量[10]。

1.4.3.6 基因檢測 用TRIzol試劑提取各組骨骼肌總RNA，測定RNA濃度和純度后，用反轉錄試劑盒合成cDNA，用PCR儀進行擴增，用SYBR PCR Master Mix試劑盒對FOXO1和GLUT4表達水平進行檢測，以GAPDH為內參。

2 結果

2.1 HE染色腓腸肌結果健康對照組腓腸肌肌肉組織、肌外膜、肌纖維均正常；模型組大鼠腓腸肌鏡下部分肌纖維彎曲，肌紅蛋白溶解，肌細胞核固縮、溶解，肌束膜破裂；低強度運動組大鼠腓腸肌少量肌纖維斷裂溶解彎曲，余未見異常；中等強度運動組大鼠腓腸肌肌肉組織、肌外膜、肌纖維基本無顯著異常，較為完整，肌纖維縱切面可見周期性橫紋(明暗相間帶)；高強度運動組鼠腓腸肌少量肌纖維斷裂溶解彎曲，余未見異常。見圖1。

圖1 HE染色腓腸肌觀察結果 ×200A：健康對照組；B：模型組；C：低強度運動組；D：中等強度運動組；E：高強度運動組

2.2 蛋白質印記檢測大鼠骨骼肌相關凋亡因子水平結果與健康對照組相比，模型組大鼠骨骼肌中Caspase-3、Caspase-9蛋白表達水平升高(P<0.05)；與模型組相比，低強度運動組大鼠骨骼肌中Caspase-3、Caspase-9蛋白表達水平降低(P<0.05)；與低強度運動組相比，中等強度運動組大鼠骨骼肌中Caspase-3、Caspase-9蛋白表達水平降低(P<0.05)；與中等強度運動組相比，高強度運動組大鼠骨骼肌中Caspase-3、Caspase-9蛋白表達水平升高(P<0.05)。見圖2、表1。

圖2 蛋白質印記檢測大鼠骨骼肌相關凋亡因子水平結果

表1 骨骼肌相關凋亡因子水平

2.3 大鼠生化指標檢測結果與健康對照組相比，模型組大鼠血糖、TC、TG、LDL升高、HDL降低(P<0.05)；與模型組相比，低強度運動組大鼠血糖、TC、TG、LDL降低、HDL升高(P<0.05)；與低強度運動組相比，中等強度運動組大鼠血糖、TC、TG、LDL降低、HDL升高(P<0.05)；與中等強度運動組相比，高強度運動組大鼠血糖、TC、TG、LDL升高、HDL降低(P<0.05)。見表2。

表2 大鼠生化指標檢測結果

2.4 ELISA法檢測大鼠炎癥因子結果由表3可以看出，與健康對照組相比，模型組大鼠IL-6、TNF-α水平升高，IL-10水平降低(P<0.05)；與模型組相比，低強度運動組大鼠IL-6、TNF-α水平降低，IL-10水平升高(P<0.05)；與低強度運動組相比，中等強度運動組大鼠IL-6、TNF-α水平降低，IL-10水平升高(P<0.05)；與中等強度運動組相比，高強度運動組大鼠L-6、TNF-α水平升高，IL-10水平降低(P<0.05)。

表3 大鼠炎癥因子結果

2.5 生物化學方法測定大鼠氧化應激反應相關物質活性與健康對照組相比，模型組大鼠SOD水平降低，LDH、MAD水平升高(P>0.05)；與模型組相比，低強度運動組大鼠SOD水平升高，LDH、MAD水平降低(P>0.05)；與低強度運動組相比，中等強度運動組大鼠SOD水平升高，LDH、MAD水平降低(P>0.05)；與中等強度運動組相比，高強度運動組大鼠SOD水平降低，LDH、MAD水平升高(P>0.05)。見表4。

表4 氧化應激反應相關物檢測結果

2.6 大鼠骨骼肌FOXO1、GLUT4 mRNA和蛋白表達水平與健康對照組相比，模型組大鼠骨骼肌中FOXO1 mRNA和蛋白表達水平升高、GLUT4 mRNA 和蛋白表達水平降低(P<0.05)；與模型組相比，低強度運動組大鼠骼肌中FOXO1 mRNA和蛋白表達水平降低、GLUT4 mRNA和蛋白表達水平升高(P<0.05)；與低強度運動組相比，中等強度運動組大鼠骼肌中FOXO1 mRNA和蛋白表達水平降低、GLUT4 mRNA和蛋白表達水平升高(P<0.05)；相比中等強度運動組，高強度運動組大鼠骨骼肌中FOXO1 mRNA和蛋白表達水平升高、GLUT4 mRNA和蛋白表達水平降低(P<0.05)。見圖3、表5。

圖3 大鼠骨骼肌FOXO1、GLUT4蛋白及mRNA表達水平

表5 大鼠骨骼肌FOXO1、GLUT4蛋白及mRNA表達水平

3 討論

骨骼肌損傷后肌細胞核會固縮、溶解，肌束膜破裂。本研究通過HE染色腓腸肌發現，使用運動療法治療后，大鼠腓腸肌肌外膜完整，可見血管及神經；肌束膜包裹肌纖維，肌纖維完整，肌細胞核大小形態未見異常。說明使用運動療法后，大鼠骨骼肌的損傷得到了有效的緩解。

糖尿病是目前腎臟病主要原因之一，其原因和自由基有密切關系。這些自由基可以促進免疫反應和炎癥反應使得患者體內相關炎癥反應加劇。目前研究較多的促炎性細胞因子包括：TNF-α、IL-1、IL-6 和IL-8 等；抗炎性細胞因子則包括：IL-4、IL-10、白介素-1等。同時也會使得糖尿病患者血清中的TC、TG、LDL增多，也會使血壓升高，損傷到血管內皮，這也是糖尿病會惡性循環，不斷加重病情的原因之一，所以抗氧化對于預防和延緩糖尿病的慢性并發癥有重要作用。本研究顯示，接受運動療法后的大鼠體內相關炎癥因子IL-6、TNF-α降低，抗炎癥因子升高。說明運動療法可以有效降低大鼠體內的炎癥反應，且中等強度的運動療法效果最佳。朱雪麗 等[11]研究表明：運動療法可有效地控制微炎癥狀態，與本研究得出的結論相一致。本研究表明接受運動療法后的大鼠體內血糖、TC、TG、LDL降低，HDL升高。亢建國[12]的研究表明：糖尿病大鼠血糖與脂代謝具有相關性，且兩者相互影響，降低了血脂，糖尿病也得到了改善，與本研究得出的結論相一致。

細胞凋亡是一種在形態學上和壞死完全不同的細胞死亡類型。Caspase家族基因是調控細胞凋亡的重要基因。Caspase 家族中主要調控凋亡的基因包括：Caspase-3和Caspase-9，其中Caspase-9可以裂解促進 proCaspase-3 產生有活性的 Caspase-3。剪切另外的 Caspase 底物，達到引起級聯反應促進細胞凋亡。本實驗顯示，使用運動療法后大鼠體內的Caspase-3和Caspase-9水平降低，說明大鼠骨骼肌細胞的凋亡受到了抑制，有效保護糖尿病大鼠的骨骼肌。譚小梅[13]的研究表明：降低體內Caspase-3和Caspase-9的水平可以有效抑制體內細胞的凋亡，減少機體的損傷，本研究得出的結論與之相一致。

氧化應激是加重大鼠糖尿病的重要原因之一，其中SOD和MAD含量可反映氧化應激的程度。除了SOD和MAD，LDH的含量也可以反映氧化應激的程度，當細胞損傷LDH會由胞內釋放到胞外。本研究發現，使用運動療法后SOD水平升高、LDH、MAD水平降低，說明大鼠體內氧化受到了抑制，降低了細胞損傷的程度。鞠禮 等[14]研究表明：降低體內過氧化反應可以有效緩解糖尿病癥狀，本研究得出的結論與之相一致。

糖尿病患者GLUT4的囊泡向胞膜移動，使得患者者血清內GLUT4含量水平會減少。本研究顯示，使用運動療法后大鼠FOXO1 mRNA和蛋白表達水平降低、GLUT4 mRNA和蛋白表達水平升高，說明運動療法可以調節大鼠血糖、血脂及炎癥反應，降低大鼠體內炎癥反應可以有效緩解大鼠糖尿病的進展。Armoni et al[15]研究表明：降低FOXO1表達、升高GLUT4可以有效降低炎癥反應，本研究得出的結論與之相一致。

綜上，運動療法可以通過升高骨骼肌GLUT4蛋白及mRNA表達水平、降低骨骼肌FOXO1蛋白及mRNA表達水平緩解糖尿病大鼠病理損傷，且中等運動強度效果最佳。