環狀RNA hsa_circ_0002715在系統性紅斑狼瘡患者全血中的表達和意義

羅 清，黃自坤，張 露，李俊明

系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)是一種病因不明的，常見的慢性系統性自身免疫性疾病，好發于育齡期婦女[1]。目前SLE的診斷主要依據臨床表現和實驗室檢查，診斷標準由美國風濕病協會制定，符合11條中的4條即可診斷[2]。用于診斷的實驗室指標主要為抗核抗體、抗雙鏈DNA、抗Sm等，但是這些自身抗體敏感性或特異性較低，患者中陽性率也較低，有一定的誤診和漏診[3]。環狀RNA(circular RNAs, circRNAs)是最近新發現的區別于傳統線性RNA的一類特殊RNA，具有閉合環狀結構[4]。此外，circRNA具有疾病和組織特異性，這使得circRNA在作為新型臨床生物標記物的開發應用上具有明顯優勢。研究[5-6]顯示circRNA可用于多種疾病的診斷、鑒別診斷、預后監測。在SLE中的作用也逐漸得到大家的認識[7]。該研究首次以全血環狀RNA hsa_circ_0002715為研究目標，探討其在SLE中臨床意義以及診斷和鑒別診斷中的價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2018年9月～2019年2月南昌大學第一附屬醫院風濕免疫科76例SLE患者，其中男6例，女70例；年齡10～66(40.2±16.4)歲，臨床診斷符合美國風濕病學會1997年修訂的分類標準[2]，并排除嚴重糖尿病、高血壓、高血脂、心腦血管疾病、肝腎疾病、血栓性疾病、血小板疾病等其他疾病。正常對照組33例，均為健康志愿者，排除炎癥或其他自身免疫性疾病，其中男4例，女29例；年齡19～84(42.5±13.3)歲。2組性別、年齡無顯著性差異。詳細收集SLE患者臨床資料及相關實驗室檢查數據，并計算其SLE疾病活動指數(systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI)。此外，選取同期收治的56例初診未治療的類風濕關節炎和32例初診未治療的強直性脊柱炎作為非SLE疾病對照組，其中男34例，女54例；年齡13～84(43.1±14.4)歲。臨床診斷分別符合美國風濕病學會1987年修訂類風濕關節炎診斷標準[8]和美國風濕性學會強直性脊柱炎修訂標準[9],并排除其他疾病。本實驗經過醫院倫理委員會批準，患者和健康人均簽署知情同意書。

1.2 SLE治療入選的76例SLE患者中47例為初診未治療者，其中7例初診未治療者于治療前和治療半個月后收集其空腹EDTA抗凝外周血用于PCR檢測。初診未治和復診SLE患者均根據病情嚴重程度選取治療方案：① 病情穩定(SLEDAI為0～4分)者維持治療；② 病情輕度活動(SLEDAI為5～9分)者用潑尼松或糖皮質激素+羥氯喹/甲氨蝶呤/來氟米特治療；③ 病情中度活動(SLEDAI為10～14分)者用糖皮質激素+環磷酰胺/霉酚酸酯治療；④ 病情重度活動(SLEDAI≥15分)者先用糖皮質激素沖擊加環磷酰胺，再按病情中度活動治療方案治療。

1.3 試劑和主要儀器TRIzol 試劑購自Invitrogen公司；PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR ? Premix Ex Taq TM購自大連寶生物 TaKaRa公司；抗雙鏈DNA抗體檢測試劑盒購自上海科新生物技術股份有限公司；抗可提取核抗原抗體檢測試劑盒購自德國歐盟公司；hsa_circ_0002715及內參基因β-actin引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；Nanodrop ND-1000 紫外分光光度計購自美國Nanodrop公司；Applied Biosystems 7500型熒光定量PCR儀器購自美國ABI公司；特定蛋白儀IMMAGE800購自美國Beckman Coulter公司；動態血沉儀購自北京普利生公司；血常規檢測儀購自日本希森美康。

1.4 全血總RNA提取采集受試者清晨空腹EDTA抗凝外周血2 ml，6 h內送檢，取250 ml全血加用750 ml TRIzol試劑處理，放-80 ℃冰箱保存。按TRIzol試劑說明書分別提取SLE患者、非SLE患者和健康對照者全血的總RNA，焦碳酸二乙酯處理過的蒸餾水溶解RNA，采用RNA純化試劑盒純化總RNA。進一步使用Nanodrop ND-1000紫外分光光度計對總RNA進行定量和質量分析。

1.5 RT-PCR檢測采用RT-PCR SYBR Green法，以β-actin作為內參進行hsa_circ_0002715的檢測。提取PBMC總RNA，DEPC水溶解后，取1 μl RNA，利用PrimeScript反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。采用20 μl反應體系進行檢測，PCR引物序列見表1。反應體系包括：1 μl反轉錄產物、0.5 μmol/L上游引物、0.5 μmol/L下游引物、1×SYBR熒光染料試劑。PCR 反應條件為：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，72 ℃、30 s，40個擴增循環。所有樣品做3個復孔。RT-PCR使用ABI7500儀器進行。分析待測標本的擴增熔解曲線，均為單峰，無非特異性擴增。根據待測標本的Ct值，采用相對定量法對RT-PCR結果進行分析，計算2-ΔΔCt。引物序列見表1。

表1 熒光定量 PCR 引物序列

1.6 SLE的其他指標檢測方法免疫球蛋白G、補體3、補體4、C-反應蛋白采用速率散色比濁法，抗雙鏈DNA抗體采用酶聯免疫吸附法，抗可提取核抗原抗體采用免疫印記法檢測，血沉采用動態血沉儀法，血常規采用電阻抗法。

1.7 統計學處理實驗數據采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，首先進行正態性檢驗，符合正態分布數據，2組樣本均數的比較采用t檢驗，否則采用非參數檢驗。多組間非參數檢驗用于3組之間的比較，同時Dunn′s post-hoc test用于多組間非參數檢驗后的兩兩比較。2個變量之間相關性采用spearman相關分析。受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析評價circRNA診斷和鑒別診斷的敏感性和特異性。以雙側P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 全血環狀RNA hsa_circ_0002715在SLE患者中表達的水平結果如圖1A所示，采用多組間非參數檢驗分析表明SLE患者、非SLE患者和健康對照者全血環狀RNA hsa_circ_0002715表達水平，差異有統計學意義(P<0.001)；此外本文采用Dunn′s post-hoc test將檢驗效能調整后，再分析3組中兩兩組間比較顯示，SLE患者全血環狀RNA hsa_circ_0002715表達水平高于對照者，差異有統計學意義(P<0.001)；SLE患者全血環狀RNA hsa_circ_0002715表達水平高于非SLE患者，差異有統計學意義(P<0.001)；但并未發現非SLE患者全血環狀RNA hsa_circ_0002715表達水平高于對照者，差異無統計學意義。

圖1 全血環狀RNA hsa_circ_0002715在健康對照者、非SLE患者、SLE患者中的表達水平

2.2 全血環狀RNA hsa_circ_0002715表達水平與SLE患者臨床參數的關系本文分析了全血環狀RNA hsa_circ_0002715表達水平與SLE患者疾病活動性評分、補體3、補體4、免疫球蛋白G、自身抗體(抗雙鏈DNA抗體、抗核小體抗體、抗SSA抗體、抗SSB抗體、抗Sm抗體、抗nRNP/Sm抗體、抗核糖體蛋白P抗體)、血沉、C-反應蛋白、狼瘡腎、血液系統損傷(白細胞數量、紅細胞數量、血紅蛋白、紅細胞比積、血小板數量、淋巴細胞數量、單核細胞數量、中性粒細胞數量)、皮疹、關節炎、脫發、漿膜炎、治療等臨床參數的關系，結果如圖2所示，SLE患者全血環狀RNA hsa_circ_0002715表達水平與補體3(rs=-0.453，P<0.001)，補體4(rs=-0.336，P=0.004)呈負相關，與抗雙鏈DNA抗體(rs=0.253，P=0.040)呈正相關，抗核小體抗體陽性的SLE患者其全血環狀RNA hsa_circ_0002715表達水平高于抗核小體抗體陰性者(P<0.001)，差異有統計學意義。此外，本研究還顯示SLE患者全血環狀RNA hsa_circ_0002715表達水平SLE患者的白細胞數量(rs=-0.486，P<0.001)、紅細胞數量(rs=-0.297，P=0.009)、血紅蛋白(rs=-0.277，P<0.016)、紅細胞比積(rs=-0.303，P=0.008)、血小板數量(rs=-0.300，P=0.009)呈負相關；但并未發現其與疾病活動性評分、狼瘡腎等臨床表現以及治療有關。

2.3 全血環狀RNA hsa_circ_0002715對SLE診斷的價值為評估全血環狀RNA hsa_circ_0002715對SLE的診斷價值，對SLE患者和健康對照者的全血環狀RNA hsa_circ_0002715表達水平進行ROC分析，結果如圖3A所示，ROC曲線下面積AUC為0.772(95%CI:0.683～0.861;P<0.001)，Cut-off值為1.939，敏感性為63.16%，特異性為81.82%，陽性預測值為88.89%，陰性預測值為49.09%，約登指數為0.450。

為評估全血環狀RNA hsa_circ_0002715對SLE的鑒別診斷價值，對SLE患者與非SLE患者中全血環狀RNA hsa_circ_0002715的表達水平進行ROC分析，結果如圖3B所示，ROC曲線下面積AUC為0.674(95%CI:0.591～0.757;P<0.001)，Cut-off值為2.612，敏感性為55.26%，特異性為72.73%，陽性預測值為63.64%，陰性預測值為65.31%，約登指數為0.280；對SLE與所有對照者(非SLE患者+健康對照者)中全血環狀RNA hsa_circ_0002715的表達水平進行ROC分析，結果如圖3C所示，ROC曲線下面積AUC為0.701(95%CI:0.624～0.777;P<0.001)，Cut-off值為3.063，敏感性為51.32%，特異性為80.17%，陽性預測值為61.90%，陰性預測值為72.39%，約登指數為0.315。

2.4 全血環狀RNA hsa_circ_0002715、anti-dsDNA、聯合環狀RNA hsa_circ_0002715-anti-dsDNA對SLE診斷價值的比較本研究前面結果表明環狀RNA hsa_circ_0002715對SLE診斷Cut-off值分別為>1.939(SLE患者vs健康對照者), >2.612(SLE患者vs非SLE患者)，>3.063(SLE患者vs非SLE患者+健康對照者)。76例SLE患者中有66例患者收集空腹EDTA抗凝外周血檢測環狀RNA hsa_circ_0002715時進行了anti-dsDNA檢測，因此分別根據上述ROC曲線獲得的Cut-off值和anti-dsDNA是否為陽性來分析三個隊列(SLE患者vs健康對照者；SLE患者vs非SLE患者；SLE患者vs非SLE患者+健康對照者)中環狀RNA hsa_circ_0002715、anti-dsDNA、聯合環狀RNA hsa_circ_0002715-anti-dsDNA對SLE診斷的敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值，結果如表2所示，環狀RNA hsa_circ_0002715的敏感性均高于anti-dsDNA，且聯合環狀RNA hsa_circ_0002715-anti-dsDNA的敏感性和特異性均最高。

圖2 全血環狀RNA hsa_circ_0002715表達水平與SLE患者臨床參數的關系

表2 環狀RNA hsa_circ_0002715、anti-dsDNA、聯合hsa_circ_0002715-anti-dsDNA對SLE的診斷價值

3 討論

研究[10]表明circRNAs在血液中可長期穩定存在，RNA酶降解作用、煮沸、反復凍融、酸堿環境、長期保存等各種處理方法均不會造成血液circRNAs的損失，比較適宜作為基本的臨床診斷標志物。近期，國內外均有學者嘗試探討circRNAs作為SLE診斷標志物的可行性，并取得了可喜的成果，如Li et al[11]發現外周血hsa_circ_0057762和hsa_circ_0003090在兒童SLE中特異性高表達，且hsa_circ_0057762表達水平與SLE患者的疾病活動性評分呈正相關，進一步ROC曲線分析發現hsa_circ_0057762和hsa_circ_0003090的AUC均大于0.8，因此hsa_circ_0057762和hsa_circ_0003090可作為兒童SLE的一種潛在的新型分子標志物；Miao et al[12]研究發現外周血單個核細胞中circPTPN22可作為SLE診斷的標志物，且其含量與SLE患者的疾病活動性和嚴重程度密切相關；此外，Ouyang et al[13]發現血漿circRNA_002453在狼瘡腎中明顯上調，并且其含量與24 h蛋白尿和SLE腎損的活動性評分呈正相關，可作為狼瘡腎診斷及嚴重程度評估的一種潛在的新型分子標志物。

圖3 SLE患者全血環狀RNA hsa_circ_0002715的受試者工作曲線分析

環狀RNA hsa_circ_0002715位于21號染色體，即21號染色體47801608-47805898(正鏈)，被 RNA 轉錄酶Ⅱ轉錄，其轉錄本有299 nt。本課題組之前研究采用芯片檢測SLE患者全血環狀RNA表達譜顯示環狀RNA hsa_circ_0002715明顯上調。目前尚未見有關環狀RNA hsa_circ_0002715的研究報道。為了研究環狀RNA hsa_circ_0002715在SLE中的表達水平及其臨床意義，本研究采用qRT-PCR檢測76例SLE患者和33例健康對照者全血中環狀RNA hsa_circ_0002715的表達水平發現，SLE患者全血環狀RNA hsa_circ_0002715表達水平顯著高于健康對照組，差異有統計學意義。 進一步分析SLE患者全血環狀RNA hsa_circ_0002715表達的臨床意義顯示，SLE患者全血環狀RNA hsa_circ_0002715表達水平與SLE患者監測疾病活動的常用指標補體[1]水平呈負相關；且SLE患者全血環狀RNA hsa_circ_0002715表達水平與anti-dsDNA、anti-nuclesome含量相關，而anti-dsDNA、anti-nuclesome也是目前臨床上常用的監測SLE患者疾病活動性指標和SLE診斷指標[1,14]；此外，本研究還顯示環狀RNA hsa_circ_0002715與SLE患者血液系統受累(WBC減少、RBC減少、PLT減少、貧血)情況相關。這些結果表明環狀RNA hsa_circ_0002715表達水平與疾病活動性和血液系統受累嚴重程度呈正相關，即患者疾病越嚴重，hsa_circ_104871分子的表達水平越高。

本研究采用ROC曲線分析環狀RNA hsa_circ_0002715的診斷價值發現，SLE患者環狀RNA hsa_circ_0002715的AUC為0.772(95%CI:0.683～0.861;P<0.001)，Cut-off值為1.939，敏感性為63.16%，特異性為81.82%，可有效地從HC中診斷出SLE患者。另外，SLE可累及關節，患者經常會有關節疼痛等癥狀，臨床上容易與RA和AS等其他自身免疫性疾病混淆，為此本研究比較了SLE患者與non-SLE患者全血環狀RNA hsa_circ_0002715的表達水平發現，SLE患者環狀RNA hsa_circ_0002715表達水平顯著高于non-SLE患者，差異有統計學意義。進一步的ROC曲線分析證實其可有效將SLE患者與non-SLE患者區別開來，可用于SLE的鑒別診斷。此外，anti-dsDNA是公認的SLE診斷指標，但其診斷敏感性較低，為40%～50%[15]，且有研究[15]顯示anti-dsDNA聯合其他SLE診斷指標可明顯提高其診斷敏感性和特異性。本研究比較hsa_circ_0002715，anti-dsDNA，聯合hsa_circ_0002715-anti-dsDNA的診斷效能顯示，hsa_circ_0002715對SLE的診斷敏感性要高于anti-dsDNA，但差異無統計學意義，而聯合hsa_circ_0002715-anti-dsDNA對SLE的診斷敏感性和特異性均提高，差異有統計學意義。因此，全血環狀RNA hsa_circ_0002715，尤其是聯合hsa_circ_0002715-anti-dsDNA是可用于SLE患者的診斷以及鑒別診斷。

綜上，SLE患者全血環狀RNA hsa_circ_0002715的表達明顯上調，且與疾病活動性和血液系統受累的嚴重程度密切相關，可作為SLE的潛在診斷及鑒別診斷標志物。相信隨著研究的深入和檢測技術的提高，CircRNAs有望成為SLE乃至其他自身免疫性疾病新的血液標志物，改變和補充傳統SLE實驗室診斷標準。