連翹苷調控炎癥的抑制作用及機制研究

楊本軍，武明飛，徐 濤

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)是一種具有高發病率和死亡率的急性炎癥性疾病[1]。ALI直接或間接由肺炎、吸入性損傷、溺水等引起，其臨床表現包括肺水腫、呼吸困難、低氧血癥[2]。雖然針對ALI已經進行了很多研究，但到目前為止，還沒有發現有效的治療藥物[3]。越來越多的研究[4]表明，抑制炎性細胞因子的過度分泌被視為治療ALI的有效策略。

連翹是我國40種常用大宗中藥材之一，具有抗氧化、保肝、降血脂等多種活性。連翹苷(phillyrin，PHN) 為連翹的干燥果實的提取物，是由兩分子苯丙素側鏈相互連接形成兩個環氧結構的一類木脂素。其結構上連橋是多種天然產物單體發揮抗氧化，抗菌和抗炎作用中起著重要基團之一[5]?；谶@一特點，在本研究中使用細胞和動物模型研究PHN抗炎活性和初步分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料PHN購自阿拉丁試劑(上海)有限公司；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)購自美國 Sigma-Aldrich公司；小鼠巨噬細胞RAW264.7作為實驗細胞株來自安徽醫科大學藥學院；PBS緩沖液、培養基(DMEM)和胎牛血清購自美國Thermo Fisher Scientific公司；10% FBS購自以色列Biological Industries公司;一氧化氮(NO)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；白介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)酶聯免疫吸附測定法(ELISA) 檢測試劑盒購自杭州聯科生物有公司；一抗購自美國Cell Signaling Technology公司；、二抗、TBST、RIPA裂解緩沖液購自上海碧云天生物技術有限公司；PVDF膜購自杭州聯科美訊生物醫藥技術有限公司；酶標儀(型號：MQX200，Bio-Tek)；分子對接軟件Discovery Studio(型號：2017 R2，BIOVIA Software)；其余試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 將RAW264.7細胞在含有10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM中,于37 ℃下，在含有5% CO2的培養條件中培養。

1.2.2炎性細胞因子的測定 將生長狀態良好的對數期RAW264.7細胞(細胞密度：6×104個細胞/孔)接種到48孔細胞培養板上，并在培養箱中孵育24 h。棄去培養基，用不同濃度的PHN及陽性對照藥物塞來昔布(celecoxib) 預處理細胞1 h，然后在LPS(0.5 μg/ ml)誘導下溫育24 h。收集上清液，并使用按照NO試劑盒Griess試劑檢測NO含量。按照ELISA試劑盒說明書，進行實驗操作測定上清液中TNF-α、IL-6 細胞因子的分泌水平。

1.2.3細胞毒性測定 將生長狀態良好的對數期RAW264.7細胞(細胞密度：6×103個細胞/孔)接種到96孔細胞培養板上，培養箱中孵育24 h。棄去培養基，用不同濃度的PHN及陽性對照藥物塞來昔布(10、20、30 μmol/L)預處理細胞1 h，然后與LPS(0.5 μg/ml)一起在培養箱中溫育24 h。通過MTT方法測試細活力，具體的方法：棄去培養基，向每個孔中加入MTT溶液(在PBS中5 mg/ml)并在37 ℃下孵育4 h。除去含MTT的培養基，然后加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)溶液，置于搖床上振蕩30 min。通過酶標儀在492 nm處檢測吸光度，并計算細胞增殖率。

1.2.4Western blot檢測 將生長狀態良好的對數期RAW264.7細胞(細胞密度：3×105個細胞/孔)接種到6孔細胞培養板上，然后培養24 h。棄去培養基，用不同濃度的PHN(1.25、2.5、5、10 μmol/L)預處理細胞12 h，然后與LPS(0.5 μg/ml)一起在培養箱中溫育1 h后提取細胞總蛋白。用含有PMSF和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液裂解細胞，然后在冰上孵育30 min。通過12% SDS-PAGE分離蛋白質裂解物，隨后轉移到PVDF膜上。將封閉的膜與指定的一抗(以抗體 ∶5% BSA溶液1 ∶1 000稀釋)在4 ℃溫育過夜。用TBST洗滌3次后，將膜與HRP偶聯的二抗在室溫下孵育1 h，以GAPDH作為內參。顯影并計算光密度值。

1.2.5分子對接 采用分子對接研究PHN與TLR4之間的潛在相互作用，使用Discovery Studio，軟件進行模擬測試。TLR4蛋白(PDB代碼：2Z64)的X射線晶體結構獲自RCSB蛋白質數據庫。將TLR4蛋白晶體結構導入DS軟件中，對蛋白結構進行去水、加氫處理，然后利用該軟件中的準備蛋白工具對蛋白進行處理。PHN結構進行能量最小化處理。使用CDOCKER模塊進行分子對接研究。

1.2.6體內實驗 50只雄性C57BL/6小鼠(體重18～25 g)購自安徽醫科大學實驗動物中心。將C57BL/6小鼠隨機分為5組(n=10)，分別對照組(生理鹽水)、模型組、PHN低劑量組、PHN中劑量組、PHN高劑量組。對照組小鼠正常飼養，除了對照組外，其余組通過尾靜脈注射20 mg/kg LPS。在注射LPS之前0.5 h，PHN低劑量組和PHN高劑量組通過腹膜內注射分別給予濃度為10 mg/kg和20 mg/kg的PHN。在LPS注射后48 h對小鼠進行麻醉并處死。收集肺組織并將其固定在4%多聚甲醛溶液中，然后包埋在石蠟中。脫水后用蘇木精和伊紅(HE)染色切片并進行免疫組織化學染色。該研究經安徽醫科大學倫理委員會批準。

2 結果

2.1 PHN抑制LPS誘導的NO釋放用LPS處理RAW 264.7細胞導致炎癥因子的分泌，包括NO、IL-6和TNF-α。與空白對照組相比，LPS模型組細胞上清液的NO含量明顯增加。PHN作用的細胞上清液中NO含量明顯低于LPS模型組。其中，當濃度為10 μmol/L時，PHN對NO釋放的抑制率為63.34%；當濃度為20 μmol/L時，抑制率為45.49%(P<0.05)(圖1)。

圖1 PHN對LPS誘導的RAW264.7細胞中NO釋放的抑制率

2.2 細胞毒性評估為了避免對NO釋放的抑制作用與細胞活力相關，采用MTT測定法檢測不同濃度PHN及塞來昔布對細胞活力的影響。如圖2，PHN和陽性藥物在不同濃度范圍內(10、20、30 μmol/L)對細胞增殖無明顯抑制作用，細胞存活率均大于95%，不同劑量的PHN組間差異無統計學意義。結果表明PHN的抗炎活性不是由細胞毒作用介導的。因此，PHN的抗炎作用機制值得進一步探索。

圖2 PHN對RAW264.7細胞活力的影響

2.3 PHN抑制LPS誘導的細胞因子分泌用PHN進一步評估LPS誘導的TNF-α和IL-6分泌量的影響作用。當予以0.625、1.25、2.5、5和10μmol/L PHN時，IL-6濃度分別降低到(840.66±8.09)、(781.67±13.59)、(644±13.45)、(516.66±44.09)和(452.66±23.56) pg/ml(圖3A)，TNF-α濃度分別降低到(2 255.67±67.36)、(2 037.66±42.31)、(1 691.66±13.19)、(1 493.66±39.57)和(1 294.33±84.68) pg/ml(圖3B)。該結果表明PHN以濃度依賴性方式降低IL-6和TNF-α分泌。

圖3 PHN對RAW264.7細胞中LPS誘導的細胞因子分泌量的變化

2.4 PHN抑制LPS誘導的TLR4表達課題組研究了TLR4的表達是否受到PHN的調控。如圖4所示，LPS(0.5 mg/mL)刺激的RAW264.7細胞可顯著增強TLR4的表達。PHN通過以濃度依賴性方式，抑制了TLR4的表達水平。該結果再次證明PHN可以抑制LPS誘導的RAW264.7細胞中的炎性反應。

圖4 PHN對LPS誘導RAW264.7細胞TLR4蛋白表達水平的影響

2.5 PHN結合TLR4的對接分析為了闡明PHN可以抑制炎性細胞因子分泌的機制，通過分子對接來研究PHN與TLR4(PDB代碼：2Z64)之間的結合模式。對接結果顯示，PHN與TLR4之間的結合能量最高打分為440.571 kJ/mol 如圖5所示，PHN通過與TLR4上的THR614和ASP619形成2個常規氫鍵，與GLU611、SER623、CYS580、ASP619和ASN622形成7個碳氫鍵，以及多個范德華力等。以上結果表明，PHN與TLR4的活性位點穩定結合，兩者之間具有較好的親和力。

圖5 PHN插入TLR4活性位點的結合模式圖

2.6 PHN對LPS誘導的ALI小鼠的保護作用通過肺組織切片病理形態學變化評估PHN對LPS誘導的ALI小鼠模型的保護作用。如圖6所示，在正常小鼠中，肺泡結構清晰、完整，肺泡腔內無分泌物和炎性細胞浸潤。LPS刺激導致顯著的炎癥改變，用PHN預處理LPS誘導的肺損傷炎癥小鼠，則明顯地改善了肺組織病變，肺泡腔炎性細胞減少，肺小葉的組織結構完整，并且低劑量組的改善作用優于高劑量組。結果表明，PHN對LPS誘導ALI小鼠模型的組織病理損傷具有保護作用。

圖6 PHN改善LPS誘導的急性肺損傷模型的病理變化HE染色×100

3 討論

當受到外界刺激時，機體做出的適應性反應，如急性炎癥，是人體極為重要的病理過程。受到外界刺激后，炎性細胞主力軍之一的巨噬細胞會產生大量炎性因子促進炎癥反應和組織損傷[6]。促炎細胞因子在疾病的防御中發揮重要作用。然而，不受控制和過量釋放促炎介質，如NO、IL-6、TNF-α、IL-1β等，可導致多種類型的炎癥性疾病，如ALI[7]。ALI是由于過度炎癥引起的嚴重疾病，表現為急性呼吸窘迫、非心源性肺水腫和低氧血癥[8]。已經證實NO、TNF-α、IL-6等，通過一系列細胞信號通路調節ALI的發病進程[9]。

LPS是革蘭陰性細菌主要的致病因子之一，可以引起人及動物多種急、慢性炎癥反應，從而導致組織器官的損傷。據報道，液體咽后壁吸入LPS所造成的肺部炎癥比較均一穩定，并且可以進行定量研究[10-11]。其機制可能是LPS通過激活其主要受體TLR4起作用，觸發先天免疫系統，隨后激活MAPK以誘導釋放促炎細胞因子。在用LPS刺激后，TLR4啟動一系列信號級聯，導致MAPK的活化，從而誘導促炎性細胞因子如NO、TNF-α和IL-6的分泌[12]。

本研究采用LPS誘導巨噬細胞RAW264.7損傷模型，考察PHN對ALI的病程發展中起關鍵作用的各種炎性細胞因子，如NO、IL-6和TNF-α的變化影響。初步結果表明，與空白對照組比較，0.5 μg/ ml LPS能顯著提高NO、IL-6和TNF-α的分泌量(P<0.01)，說明細胞炎癥的模型成功建立；與模型組比較，PHN以劑量依賴性方式抑制NO、IL-6和TNF-α的分泌(P<0.05或P<0.01)。并且在30 μmol/L以下濃度范圍，PHN對細胞增殖無明顯抑制作用。初步機制探討，PHN以濃度依賴性方式通過抑制TLR4信號傳導途徑調節ALI的發病機制(P<0.05或P<0.01)。根據分子對接結果分析，PHN通過與TLR4上重要氨基酸殘基THR614、ASP619、GLU611等形成了9個牢固氫鍵，結合能量最高打分為440.571 kJ/mol。提示PHN與TLR4蛋白之間具有較強的親和力。通過肺組織病理檢查，LPS的吸入可導致小鼠出現嚴重的肺損傷，包括肺水腫、炎性細胞浸潤和肺泡結構的破壞，說明小鼠急性肺炎模型的建立是成功的。在接受PHN治療后，小鼠的肺水腫開始趨于緩和，肺泡腔炎性細胞數量也較未接受治療的模型組有顯著降低，肺小葉的組織結構完整，充血現象也有所減輕。本研究表明PHN在小鼠ALI模型中有效地減少了LPS誘導的肺部炎癥和急性肺損傷。

綜上所述，PHN可以有效地抑制LPS誘導的肺部感染引發的炎癥反應的發展進程，對急性炎癥導致的肺損傷有較顯著的保護作用，其機制可能是影響 TLR4信號通路，抑制RAW264.7細胞的相關炎性因子的分泌有關。因此，PHN在臨床ALI的治療中具有潛在的研究價值。